Oncogeni ed Oncosoppressori

Cosa causa il cancro? Cellula Normale E’ una malattia genetica? E’ una malattia ereditaria? Solo occasionalmente, il fine controllo che regola la moltiplicazione cellulare si rompe. Una cellula che inizia a crescere e dividere in maniera sregolata trasmette alle cellule figlie la propensione a proliferare senza rispondere alla regolazione, il risultato è un clone di cellule capace di espandersi indefinitivamente. Infine, da questo clone di cellule indesiderate si forma una massa chiamata tumore. Alcuni tumori non hanno conseguenze serie per la salute, ma quelli composti da cellule che diffondono in tutto il corpo causano malattia. Il cancro è causato da mutazioni, ma ci sono due differenze fondamentali fra il cancro e le malattie genetiche. Cellula Tumorale

Cancro Cellula Normale Radiazioni Cancerogeni chimici UV Virus Cellula Normale Accumulo abnorme di cellule causato da alterazioni nella: Proliferazione Apoptosi Riparazione del DNA Differenziazione Un cancro non è causato da una singola mutazione, ma piuttosto da un insieme di 3 o forse anche più di 20 mutazioni, dipende dal tipo di cancro, nei geni che normalmente regolano la moltiplicazione cellulare. Cancer is caused by alterations or mutations in the genetic code Can be induced in somatic cells by: Carcinogenic chemicals Radiation Some viruses Heredity - 5% Cellula Tumorale

Alterata proliferazione cellulare e cancro Ogni cellula contiene ~ 30-40,000 geni Alcuni geni sono responsabili del controllo della proliferazione cellulare Se in questi geni avviene una mutazione, la proliferazione diventa anomala L’anomala proliferazione è una caratteristica del cancro

che controllano la proliferazione UV Errori di replicazione Cancerogeni chimici Radiazioni Cellula Normale Virus Danno al DNA Riarrangiamenti (traslocazioni, delezioni, Amplificazione) Mutazioni puntiformi Alterazioni al DNA di geni che controllano la proliferazione Cellula Tumorale

1. Cellula somatica normale 2.Espansione clonale con mutazione iniziale 1. Cellula somatica normale 4.Ulteriore espansione di un subclone con mutazione addizionle Accumulo multifasico di mutazioni somatiche nella cancerognesi molecolare. La mitosi di una cellula somatica produce due cellule con l’esatta copia del genoma. Una mutazione viene acquisita nella mitosi successiva che porta un vantaggio selettivo alla cellula somatica mutata. Questo è un prerequisito per l’espansione clonale. Le cellule figlie da questo clone possono acquisire ulteriori mutazioni, che conferiscono ulteriori vantaggi di selezione, e permettono la stabilizzazione di sottocloni A e B all’interno dell’originale neoplasia 3. Espansione di un subclone A con una nuova mutazione e la mutazione iniziale

Nelle cellule normali il controllo della proliferazione avviene in specifiche fasi del ciclo cellulare Segnali proliferativi positivi attività metabolica e crescita cellulare attività metabolica e crescita cellulare Segnali proliferativi negativi

Come è controllata la proliferazione cellulare? Il ciclo cellulare e la divisione cellulare sono controllati dalla regolata espressione di geni L’integrità genomica di tutte le cellule dipende dall’attenta attività dei geni riparativi soprattutto in cellule più esposte all’azione di genotossici Coinvolge l’equilibrio tra l’espressione di geni responsabili per la regolazione positiva della proliferazione e l’espressione di geni responsabili per la regolazione negativa della proliferazione La moltiplicazione delle cellule è regolato e risponsivo alle specifiche necessità dell’organismo. In un soggetto giovane la moltiplicazione cellulare eccede la morte cellulare, nell’adulto il processo di nascita e morte cellulare è bilanciato per produrre uno stato di quiescenza. Alcuni tipi di cellule dell’adulto si rinnovano rapidamente: le cellule intestinali hanno una emivita di pochi giorni prima di morire ed essere rimpiazzate. Le cellule del sangue hanno circa 100 giorni di emivita, le cellule del fegato sano raramente muoiono, e nell’adulto c’è una lenta perdita delle cellule cerebrali senza rimpiazzo.

Cellula Normale Cellula Tumorale Perdita di funzione di uno o più geni oncosoppressori Abnorme espressione di uno o più oncogeni Cellula Tumorale

An oncogene incorporated into a retroviral genome differs in several respects from the corresponding proto-oncogene. First, the viral oncogene is transcribed under the control of viral promoter and enhancer sequences, rather than being controlled by the normal transcriptional regulatory sequences of the proto-oncogene. Consequently, oncogenes are usually expressed at much higher levels than the proto-oncogenes and are sometimes transcribed in inappropriate cell types. In some cases, such abnormalities of gene expression are sufficient to convert a normally functioning proto-oncogene into an oncogene that drives cell transformation. Both gene transfer assays and alternative experimental approaches have since led to the detection of active cellular oncogenes in human tumors of many different types In addition to such alterations in gene expression, oncogenes frequently encode proteins that differ in structure and function from those encoded by their normal homologs. Many oncogenes, such as raf, are expressed as fusion proteins with viral sequences at the amino terminus Proto-oncogeni conosciuti. Mutazioni nei proto-oncogeni causano il cancro.

Proteine codificate dagli oncogeni Proteine che partecipano al controllo della crescita cellulare. Il cancro può essere causato dall’espressione di forme mutate di queste proteine: fattori di crescita (I), recettori per fattori di crescita (II), proteine del segnale (III), fattori di trascrizione (IV), proteine pro- o anti-apoptotiche (V), proteine che controllano il ciclo cellulare (VI), e proteine che riparano il DNA (VII). Mutazioni delle proteine di classe I – IV danno origine ad oncogeni dominanti attivi. Le proteine di VI classe sono tumor suppressors, mutazioni in questi geni causano la perdita del controllo della proliferazione della cellula. Mutazioni della Classe VII aumenta la probabilità di mutazioni nelle altre classi.

Cellula Normale Cellula Tumorale UV Errori di replicazione Cancerogeni chimici Radiazioni Cellula Normale Virus Danno al DNA Riarrangiamenti (traslocazioni, delezioni, Amplificazione) Mutazioni puntiformi Alterazioni al DNA di geni che controllano la proliferazione (oncogeni e geni oncosoppressori)- Proliferazione sregolata Cellula Tumorale

La scoperta dei “geni del cancro” nasce da due osservazioni (fine anni ‘70) Sequenze geniche di retrovirus oncògeni (v-onc) sono omologhe a sequenze di normali geni cellulari (c-onc) da questi “catturati” Segmenti genici estratti da tumori trasformano cellule normali in cellule neoplastiche

Trasformazione cellulare da parte di un virus del sarcoma Rous (RSV) e di un avian leukosis virus (ALV). Entrambi i virus infettano e si replicano nei fibroblasti di pollo, ma solo i RSV inducono trasformazione cellulare

Il genoma del retrovirus contiene un gene addizionale, l’src, che non è presente nell’AVL e codifica una protein-tyrosine kinase p60src

Isolamento del virus della leucemia di Abelson. Il virus altamente oncogeno Ab-MuLV fu isolato da un raro tumore che si sviluppava in un topo in cui era stato inoculato un virus non trasformante (Moloney murine leukemia virus, or MuLV), contente solo i geni gag, pol, and env necessari per la replicazione virale. Invece, Ab-MuLV aveva acquisito un nuovo oncogene (abl), responsabile della sua capacità trasformante. L’oncogene abl rimpiazza alcuni geni replicativi ed è fuso con un gene gag parzialmente deleto (Δgag) nel genoma Ab-MuLV.

Questo scenario suggeriva l’ipotesi che gli oncogeni retrovirali derivano da geni della cellula ospite, e che occasionalmente tale gene cellulare viene incorporato in un genoma virale, producendo un nuovo virus altamente oncogenico come prodotto di un evento di ricombinazione virus-ospite

Le cellule normali contengono geni che sono strettamente correlati agli oncogeni retrovirali

I geni delle cellule normali da cui originano gli oncogeni retrovirali sono i proto-oncogeni. Sono importanti geni regolatori, codificanti proteine coinvolte nei pathways di trasduzione del segnale che controllano la normale proliferazione cellulare (es.: src, ras, and raf). Gli oncogeni sono espressi in maniera abnorme o sono forme mutate dei corrispondenti proto-oncogeni. Come conseguenza di tali alterazioni gli oncogeni inducono l’ abnorme proliferazione cellulare e lo sviluppo tumorale.

Proteine che partecipano al controllo della crescita cellulare Proteine che partecipano al controllo della crescita cellulare. Il cancro può essere causato dall’espressione di forme mutate di queste proteine: fattori di crescita (I), recettori per fattori di crescita (II), proteine del segnale (III), fattori di trascrizione (IV), proteine pro- o anti-apoptotiche (V), proteine che controllano il ciclo cellulare (VI), e proteine che riparano il DNA (VII). Mutazioni delle proteine di classe I – IV danno origine ad oncogeni dominanti attivi. Le proteine di VI classe sono tumor suppressors, mutazioni in questi geni causano la perdita del controllo della proliferazione della cellula. Mutazioni della Classe VII aumenta la probabilità di mutazioni nelle altre classi.

Proto-oncogeni conosciuti Proto-oncogeni conosciuti. Mutazioni nei proto-oncogeni che causano il cancro.

Studio di un oncogene tumorale umano mediante transfezione di DNA estratto da un carcinoma della vescica umano in cellule murine; esso induce la trasformazione delle cellule murine. La transformazione è causata dall’integrazione ed espressione di un oncogene derivato dal tumore umano

Principali meccanismi per cui un proto-oncogene può diventare un oncogene Traslocazione: Un gene si trova in un nuovo locus, sotto un nuovo controllo Amplificazione genica: Copie multiple di un gene Mutazione puntiforme Nuovo Promoter Principali meccanismi per cui un proto-oncogene può diventare un oncogene. Un quarto meccanismo coinvolge la ricombinazione tra il DNA retrovirale ed un proto-oncogene (Figura dopo). Questo ha effetti simili a quelli del riarrangiamento cromosomico, portando il proto-oncogene sotto il controllo di un enhancer virale. Conversion, or activation, of a proto-oncogene into an oncogene generally involves a gain-of-function mutation. At least three mechanisms can produce oncogenes from the corresponding proto-oncogenes. • Point mutations in a proto-oncogene that result in a constitutively acting protein product • Localized reduplication (gene amplification) of a DNA segment that includes a proto-oncogene, leading to overexpression of the encoded protein • Chromosomal translocation that brings a growth-regulatory gene under the control of a different promoter and that causes inappropriate expression of the gene An oncogene formed by the first mechanism encodes an oncoprotein that differs slightly from the normal protein encoded by the corresponding proto-oncogene. In contrast, the latter two mechanisms generate oncogenes whose protein products are identical with the normal proteins; their oncogenic effect is due to their being expressed at higher-than-normal levels or in cells where they normally are not expressed. However they arise, the gain-of-function mutations that convert proto-oncogenes to oncogenes act dominantly; that is, mutation in only one of the two alleles is sufficient for induction of cancer. Proteina in eccesso Proteina in eccesso Proteina iperattiva

Attivazione di un oncogene per mutazione puntiforme

Mutazione puntiforme nell’ oncogene ras. Un singolo nucleotide cambiato, che altera il codone 12 da GGC (Gly) a GTC (Val), è responsabile dell’attività transformante del oncogene ras

Mutazione puntiforme L’effetto di questa mutazione missenso crea un oncoproteina Ras che non idrolizza GTP a GDP. L’oncoproteina Ras rimane nel complesso Ras–GTP attivo ed attiva continuamente la serine/threonine kinase downstream This simple mutation reduces the protein's GTPase activity, thus linking GTP hydrolysis to the maintenance of normal, controlled Ras function. The oncogenic change causes only a slight alteration in the three-dimensional structure of Ras, but this is sufficient to change the normal protein into an oncoprotein. Constitutively active Ras oncoproteins are expressed by many types of human tumors including bladder, colon, mammary, skin, and lung carcinomas, neuroblastomas, and leukemias. Ras proteins are anchored to the inner side of the cell's plasma membrane by a particular type of covalently attached fatty acid called a farnesyl group ; this attachment is essential for either normal or oncogenic Ras proteins to function as signal transducers. Inhibitors of farnesyl transferase, the enzyme that adds the farnesyl group, prevent membrane localization of Ras. Such inhibitors, which have been shown to reduce the abnormal proliferation of cultured cells transformed by the ras oncogene, are now in clinical trials for treatment of several tumors, including colon cancer.

Il ciclo della proteina Ras tra la forma inattiva legata al GDP e la forma attiva legata al GTP avviene in 4 fasi. Il legame dei fattori di crescita ai loro recettori induce la formazione del complesso attivo Ras/GTP. Fase 1: Guanine nucleotide – exchange factor (GEF) facilita la dissociazione del GDP dal Ras. Fase 2: GTP si lega spontaneamente, e il GEF si dissocia lasciando Ras /GTP in forma attiva. Fase 3 e 4: Idrolosi di GTP per generare la forma Ras/GDP inattiva, accelerata da GTPase-activating protein (GAP) o SOS.

Mutazione puntiforme L’effetto di questa mutazione missenso crea un oncoproteina Ras che non idrolizza GTP a GDP. L’oncoproteina Ras rimane nel complesso Ras–GTP attivo ed attiva continuamente la serine/threonine kinase downstream

Regolazione dell’attività di Src e sua attivazione per mutazione. Struttura del dominio di c-Src e v-Src. La fosforilazione nella tirosina 527 da parte di Csk, un’altra tyrosine kinase, inattiva l’attività Src kinase. L’oncoproteina transformante v-Src codificata dal Rous sarcoma virus manca di 18 amino acidi C-terminal compresa la tirosina 527 e così è constitutivamente attiva. Effetto della fosforilazione sulla conformazione di c-Src. Il legame della fosfotirosina 527 al dominio SH2 induce cambiamenti conformazionali sui domini SH3 e kinase, con distorsione il sito attivo della kinase sicchè è cataliticamente inattivo. L’attività della kinase di c-Src è normalmente attivato con la rimozione del fosfato sulla tirosina 527.

Attivazione di un oncogene per delezione

Effetti di mutazione in proto-oncogeni che codificano recettori di superficie. Una mutazione che altera un singolo aminoacido, nella regione transmembrana del recettore Her2R causa la dimerizzazione di due recettori in assenza del ligando correlata all’EGF e rende la proteina costitutivemente attiva. Una delezione che causa la perdita del ligand binding domain extracellulare nel recettore EGF porta all’ attivazione costitutiva della proteina kinasi

La proteina del proto-oncogene Raf è formata da amino-terminal regulatory domain ed un carboxy-terminal protein kinase domain. Nella proteina dell’ oncogene virale Raf, il regulatory domain è deleto e rimpiazzato dalle sequenze virali Gag. Come risultato, il Raf kinase domain è constitutivamente attivo, causando transformazione cellulare.

Attivazione di un oncogene per traslocazione

Translocazione del c-myc Translocazione del c-myc. Nel linfoma di Burkitt il protoncogene c-myc è traslocato dal cromosome 8 al locus delle catene pesanti delle immunoglobuline (IgH) sul cromosome 14, che causa un’abnorme espressione del c-myc

Traslocazione di abl. Nella LMC l’ oncogene abl è traslocato dal cromosoma 9 al cromosoma 22, formando il cromosome Ph. Il protoncogene abl, che contiene due primi esoni alternativi (1A e 1B), si congiunge a metà del gene bcr sul cromosome 22. L’esone 1B è deleto come risultato della translocazione. La trascrizione del gene fuso inizia sul promoter bcr e continua verso abl. Lo splicing genera un mRNA Bcr/Abl, in cui le sequenze dell’esone 1A abl sono delete e le sequenze bcr sono congiunte all’esone 2 di abl.

Riarriangemento cromosomico nel lifoma follicolare Riarriangemento cromosomico nel lifoma follicolare. La traslocazione fonde gli elementi trascrizionali enhancer di un gene, sul cromosoma 14, all’unità trascizionale di un’altro gene, sul cromosoma 18, che codifica Bcl2, La proteina Bcl2 così viene prodotta dalle plamsma -cellule

Attivazione di un oncogene per inserzione

Attivazione di c-myc proto-oncogene per inserzione di promoter retrovirale o di un enhancer. Il promoter può essere attivato quando il retrovirus si inserisce upstream (5′) degli esoni di c-myc. Il LTR di destra può agire da promoter. Il gene c-myc può anche essere attivato quando un retrovirus inserisce upstream del gene c-myc nella direzione trascrizionale opposta; un LTR virale agisce da enhancer, activando la trascrizione dalla sequenza del promoter di c-myc.

Oncogene Type of cancer Activation mechanism abl akt Chronic myelogenous leukemia, acute lymphocytic leukemia Translocation akt Ovarian and pancreatic carcinomas Amplification bcl-2 Follicular B-cell lymphoma D1 Parathyroid adenoma, B-cell lymphoma Squamous cell, bladder, breast, esophageal, liver, and lung carcinomas E2A/pbx1 Acute lymphocytic leukemia erbB-2 Breast and ovarian carcinomas gip Adrenal cortical and ovarian carcinomas Point mutation gli Glioblastoma gsp Pituitary and thyroid tumors hox-11 Acute T-cell leukemia lyl c-myc Burkitt's lymphoma Breast and lung carcinomas L-myc Lung carcinoma N-myc Neuroblastoma, lung carcinoma PDGFR Chronic myelomonocytic leukemia PML/RARα Acute promyelocytic leukemia rasH Thyroid carcinoma rasK Colon, lung, pancreatic, and thyroid carcinomas rasN Acute myelogenous and lymphocytic leukemias, thyroid carcinoma ret Multiple endocrine neoplasia types 2A and 2B DNA rearrangement SMO Basal cell carcinoma

Oncogeni che codificano per fattori di crescita

Stimolazione di crescita autocrina. Una cellula produce un fattore di crescita al quale risponde, con il risultato di una continua stimolazione della proliferazione cellulare

Meccanismo dell’attivazione dell’oncogene Tel/PDGFR. Il PDGFR normale è attivato dalla dimerizzazione indotta dal legame con PDGF. L’ oncogene Tel/PDGFR codifica una proteina nella quale il dominio extracellulare normale del PDGFR e rimpiazzato da una sequenza N-terminale del fattore di trascrizione Tel. Queste sequenze dimerizzano in assenza di PDGF, con attivazione costitutiva della protein-kinase.

Oncogeni che codificano per recettori di membrana

Molecole del segnale extracellulare si possono legare sia a recettori extracellulari che intracellulari. Molte molecole del segnale sono idrofile e non possono attraversare la membrana cellulare e si legano ai recettori di superficie cellulare, che generano segnali all’interno della cellula target. Alcune molecole del segnale, diffondono attraverso la membrana plasmatica e si legano a recettori all’interno della cellula target nel cytosol o nel nucleo. Molte di queste molecole sono idrofobiche; sono trasportate dal flusso sanguigno e altri fluidi legate a proteine carrier, dai quali si dissociano prima di entrare nella cellula target.

Recettori tirosin-kinasi Sei famiglie di recettori tyrosin- kinasi. In alcune sottofamiglie il dominio tyrosin-kinasi e interrotto da una "kinase insert region".

Auto-fosforilazione dei recettori tirosin-chinasi

Tre classi di recettori di superficie cellulare

Recettori Enzyme-linked (1) recettori guanilil cyclasi, che catalizzano la produzione del cGMP nel cytosol; (2) recettori tirosin- kinasi, che fosforilano specifici residui tirosina su un piccolo gruppo di proteine del segnale intracellulari; (3) recettori tirosin-kinasi-associati, che sono associati a proteine con attività tyrosin-kinasi; (4) recettori tirosin- fosfatasi, che rimuovono i gruppi fosfato dai residui di tirosina di specifiche proteine del segnale intracellulari; (5) recettori serine/treonine kinasi, che fosforilano specifici residui di serina o treonina da alcune proteine intracellulari.

I due principali meccanismi intracellulari del segnale hanno caratteristiche comuni. In entrambi I casi una proteina del segnale è attivata all’ addizione di un gruppo fosfato e inattivato dalla rimozione del fosfato. Il P è aggiunto covalentemente alla proteina del segnale da una protein kinase; La proteina del segnale è indotta a cambiare il suo legame GDP a GTP.

Schema dei recettori legandi a G-protein. Recettori con 7 domini transmembranacei accoppiati alle proteine G eterodimeriche. - Accoppiati all’adenil ciclasi - Accoppiati a canali ionici - Accoppiati a PLC     Schema dei recettori legandi a G-protein. The parts of the intracellular domains that are mainly responsible for binding to trimeric G proteins are shown in orange, while those that become phosphorylated during receptor desensitization (discussed later) are shown in red.

Pathways principali mediante I quali i recettori di superficie legati alle G-protein generano mediatori intracellulari. In entrambi I casi il legame ad un ligando extracellulare altera la conformazione del dominio citoplasmatico del recettore, che si lega alla G-protein e attiva (o inattiva) un enzima della plasma membrana. Nel pathway del cAMP l’enzima produce direttamente cAMP. Nel pathway Ca2+ l’enzima produce un mediatore solubile (IP3) che rilascia Ca2+ dal reticolo endoplasmico. Entrambi cAMP e Ca2+ inducono il segnale legandosi a proteine specifiche, e alterando la loro conformazione e quindi la loro attività

Oncogeni e segnale di trasduzione Oncogeni e segnale di trasduzione. Gli oncogeni agiscono da fattori di crescita (es. EGF), recettori di fattori di crescita (es. ErbB), e molecole del segnale intracellulari (Ras and Raf). Ras e Raf attivano il pathway ERK MAP kinase, inducendo geni addizionali (e.g., fos) che codificano potenzialmente proteine oncogeniche che sono regolatori trascrizionali. Le proteine con potenziale oncogenico sono evidenziate in giallo

Azione dell’ oncogene PML/RAR α PML/RARα blocca la differenziazione da promielociti a granulociti.

Oncogeni e sopravvivenza cellulare Oncogeni e sopravvivenza cellulare. Gli oncogeni che segnalano la sopravvivenza cellulare sono fattori di crescita, recettori per fattori di crescita , PI 3-kinase, and Akt. Il segnale del pathway PI 3-kinase/Akt regola membri della famiglia di Bcl-2, che promuove la sopravvivenza cellulare inibendo il rilascio del citocrome c dai mitocondri. Proteine con potenziale oncogenico sono in giallo

Il Cancro è una malattia ereditaria? -15% dei casi di tumore hanno una componente ereditaria

Geni adibiti al riparo del DNA (caretakers) La loro mutazione è spesso alla base di sindromi neoplastiche familiari 2. Prototipo sono i geni hMLH1, hPMS1e hPMS2, mutati nell’Hereditary Non Polyposis Colon Cancer (HNPCC); i geni BRCA-1 e BRCA-2, mutati nel carcinoma della mammella; il gene ATM (atassia-teleangectasia) 3. La mutazione di questi geni non influenza direttamente la crescita cellulare né l’apoptosi ma favorisce la trasformazione e accelera la progressione neoplastica. 4. Gli individui affetti presentano instabilità di particolari regioni del DNA (coppie ripetute di 1-6 nucleotidi) denominate microsatelliti

Cancro Familiare L’ereditarietà di una mutazione predisponente in un oncogene: - RET sindromi tumorali – Carcinoma Familiare della Midollare della tiroide (FMTC) e Neoplasia Endocrina Multipla Tipo 2A (MEN 2A) - MET nel cancro ereditario papillare renale - CDK4 nel melanoma familiare L’ereditarietà di una mutazione predisponente in un gene oncosoppressore L’ereditarietà di una mutazione predisponente in un gene che ripara il DNA

Cancro Familiare Una singola mutazione è insufficiente a causare il cancro Ulteriori alterazioni in altri geni sono necessarie all’insorgenza del cancro

Sviluppo e metastasi del Ca colorettale cancer e basi genetiche Sviluppo e metastasi del Ca colorettale cancer e basi genetiche. Una mutazione nel tumor-suppressor gene APC in una cellula epiteliale ne causa la divisione, si forma una massa benigna un polipo. Ulteriori mutazioni inducono l’ esspressione di Ras e la perdita di due tumor-suppressor genes, DCC and p53, genera una cellula maligna con tutte le 4 mutationi; la progenie di questa cellula invade la lamina basale. Alcune cellule tumorali invadono I vasi, e invaderanno altri siti del corpo. studies have identified a series of mutations that commonly arise in a well defined order, providing strong support for the multi-hit model. Invariably the first step in colon carcinogenesis involves loss of a functional APC gene; however, not every colon cancer acquires all the later mutations or acquires them in the same order. Polyps are precancerous growths on the inside of the colon wall. Most of the cells in a polyp contain the same one or two mutations in the APC gene that result in its loss or inactivation; thus they are clones of cells in which the original mutations occurred. APC is one of many tumor-suppressor genes, most of which encode proteins that inhibit the progression of certain types of cells through the cell cycle. APC does so by inhibiting the ability of the Wnt protein to activate expression of the myc gene. The absence of functional APC protein thus leads to inappropriate activation of Myc, a transcription factor that induces expression of many genes required for the transition from the G1 to the S phase of the cell cycle. Both alleles of the APC gene must carry an inactivating mutation for polyps to form, because cells with one wild-type APC gene express enough APC protein to function normally. If one of the cells in a polyp undergoes another mutation, this time an activating mutation in the ras gene, its progeny divide in an even more uncontrolled fashion, forming a larger adenoma (see Figure 24-6). Mutational loss of another tumor-suppressor gene, designated DCC, followed by inactivation of the p53 gene, results in a malignant carcinoma. DNA from different human colon carcinomas generally contains mutations in all these genes — APC, p53, K-ras, and DCC — establishing that multiple mutations in the same cell are needed for the cancer to form. Some of these mutations appear to confer growth advantages at an early stage of tumor development, whereas other mutations promote the later stages, including degradation of the basal lamina, which is required for the malignant phenotype.

Cellula Normale Cellula Tumorale UV Errori di replicazione Cancerogeni chimici Radiazioni Cellula Normale Virus Danno al DNA Riarrangiamenti (traslocazioni, delezioni, Amplificazione) Mutazioni puntiformi Alterazioni al DNA di(0ncogeni e geni oncosoppressori)- Quando avviene un’alterazione in un gene della linea germinale Insorge un cancro familiare- Proliferazione sregolata Cellula Tumorale

Carcinoma colon/retto BRCA1 Carcinomas ovarico e della mammella BRCA2 Geni Tipi di cancro APC Carcinoma colon/retto BRCA1 Carcinomas ovarico e della mammella BRCA2 Carcinomas della mammella DPC4 Carcinoma pancreatico INK4 Melanoma; ca del polmone, tumori del cervello, leucemie, linfomi MADR2 NF1 Neurofibrosarcoma NF2 Meningioma p53 Tumori del cervello; Ca della mammella, colon/retto, esofageo, fegato, e polmone; sarcomi; leucemie e lymfomi PTC Carcinoma cellule basali PTEN Tumori del cervello; melanoma; Ca della prostata, endometrio, rene, e polmone Rb Retinoblastoma; sarcomi; ca della vescica, mammella, e polmone VHL Carcinoma cellule renali WT1 Tumore del Wilms

Ereditarietà del retinoblastoma La suscettibilità al retinoblastoma è trasmessa al 50% dei discendenti. . Hereditary retinoblastoma is inherited as an autosomal dominant trait, as illustrated in this pedigree. Affected individuals (red), who inherit one mutant allele of RB, a tumor-suppressor gene, have a high probability of developing retinal tumors in childhood. Since the RB gene is located on chromosome 13, both males and females are affected equally.

Forma ereditaria Mutazioni somatiche Mutazione del Rb nell’insorgenza del retinoblastoma. Nel retinoblastoma ereditario, una copia difettiva del gene Rb (Rb-) è ereditata dal genitore affetto. Una seconda mutazione somatica, che inattiva la singola copia normale Rb+ in una cellula di retina, porta allo sviluppo of retinoblastoma. Nei casi non ereditari, sono ereditati due geni Rb+ normali e il retinoblastoma si sviluppa se due mutazioni somatiche inattivano entrambe le copie di Rb nella stessa cellula. Forma ereditaria Mutazioni somatiche

Retinoblastoma e ciclo cellulare La cellula decide se Proseguire nel ciclo cellulare o arrestarsi Punto di restrizione Rb è il principale gene che controlla il punto R Quindi è un target (diretto o indiretto) del processo di cancerogenesi

P53 • p53 is a transcription factor. Inhibits function of genes that promote cell cycle progression • p53 induces expression of the p21 (CDKI) gene. p21 binds to G1 cyclin - cyclin-dependent kinase (Cdk) complexes. Cdks phosphorylate specific substrates inducing cell cycle progression. Binding of p21 blocks this function • Blocks progression of cells through the G1 phase of the cell cycle • p53 induces expression of bax. Promotes apoptosis • Mutations in the p53 gene have been detected in more than 50% of sporadically occurring human tumors. • p53 protein appears to be latent or inactive in normal cells and becomes activated for sequence-specific DNA binding by a variety of stimuli, including DNA damaging agents such as ultra-violet or gamma irradiation

Ruolo di p53 nel Controllo del ciclo cellulare

Il Retinoblastoma inibisce la trascrizione di geni contenenti siti di legame per i fattori di trascrizione E2F Retinoblastoma inhibits transcription of genes containing binding sites for E2F transcription factors Esempio di controllo inibitorio della progressione del ciclo cellulare. Nei mammiferi la transizione G1 / S necessita della fosforilazione della proteina Rb da parte del complesso CDK2–ciclina. In caso di danno al DNA, la proteina p53 è indotta, e a sua volta induce la proteina p21. Gli elevati levelli di p21 inibiscono l’attività protein kinase del complesso CDK2–cyclin. Quando il DNA danneggiato è riparato, I livelli di p53 decadono. Anche I livelli di p21 diminuiscono, e l’inibizione dell’attività della protein kinase CDK2–cyclin è relieved, che permette al Rb di essere fosforilato e E2F diventa un transcription factor attivo, permettendo alla cellula di entrare il fase S.

La maggior parte dei geni oncosoppressori sono regolatori del ciclo cellulare p16 ARF pRb p53 p21 ATM Alcuni oncosoppressori bloccano il ciclo cellulare in presenza di danno al DNA o incompleta Rip. del DNA Rb Alcuni oncosoppressori sono responsabili della riparazione del DNA danneggiato S G1 G2 The expression of D-type cyclins in mammals is induced by many extracellular substances called growth factors or mitogens. These cyclins (D1, D2, and D3) assemble with their partners Cdk4 and Cdk6 to generate catalytically active kinases. Mitogen withdrawal prior to passage through the restriction point leads to accumulation of p27 or p16, which bind to and inhibit cyclin D – dependent kinase activity, thus causing G1 arrest. Another key player in cell-cycle control is the Rb protein. In its unphosphorylated form, Rb binds transcription factors collectively called E2F and thereby prevents E2F-mediated transcriptional activation of many genes whose products are required for DNA synthesis, such as DNA polymerase. Also, the Rb-E2F complex acts as a transcriptional repressor for many of these same genes. Phosphorylation of Rb protein midway through G1 causes it to dissociate from E2F, allowing E2F to induce synthesis of these DNA replication enzymes, which irreversibly commits the cell to DNA synthesis. Rb phosphorylation is initiated by an active Cdk4 – cyclin D complex and is completed by other cyclin-dependent kinases. Most tumors contain an oncogenic mutation of one of the genes in this pathway such that the cells are propelled into the S phase in the absence of the proper extracellular growth signals that regulate Cdk activity. In loro assenza, le cellule con DNA danneggiato continuano a generare nuove cellule senza riparare il danno M p21 ATM

Geni che riparano il DNA Il cancro insorge anche per difettiva riparazione del DNA Mutazioni nei geni (BRCA1, BRCA2) induce suscettibilità per il Ca della mammella Geni (MSH2, MLH1, PMS1, PMS2, MSH6) nella suscettibilità del Hereditary Non-polyposis Colon Cancer (HPNCC) Mutant DNA repair genes unable to repair mutations occurring in oncogenes nd tumor suppressor genes. Results in higher incidence in development of Cancer. Hereditary Non-Polyposis Colon Cancer (HNPCC) • Autosomal dominant inherited genetic disease accounting for approximately 15% of colorectal cancers • HNPCC patients also at increased risk for development of cancer of the endometrium,small intestine, ovary, stomach,and brain • Mean age to development of colorectal cancer is early to mid 40’s but ma occur as early as 20’s or teenage years • HNPCC may be the most common form of familial predisposition to cancer • Lifetime risk for development of any cancer is 91% (men) and 69% (women). For colorectal cancer, 74% (men), 30% (women). Hereditary Non-Polyposis Colon Cancer (cntd) • Result of mutation in a DNA repair gene controlling mismatch DNA repair. Genes are DNA proof-readers which control repair of DNA damage. • 2 DNA repair genes found mutated in 64% of HNPCC Mutation in hMSH2 in 31% HNPCC Mutation in hMLH1 in 34% HNPCC • Mutations in hPMS1 (rare, one family) hPMS2 (4%) and hMSH6 (rare, a few families) also found Inefficient DNA repair results in permanent mutations in growth regulatory genes (oncogenes and tumor suppressor genes) • Knockout mice lacking MSH2 gene develop colonic cancers with 70% incidence of APC inactivation • HNPCC cells may contain 100,000 mutations.

P16 (Hereditary Melanoma) • p16 è mutato o deleto nelle leucemie e nel cancro della testa e del collo. E’ mutato nel melanoma comprese le forme familiari della malattia. • p16 è un membro della famiglia INK4 degli inibitori cyclin dependent kinase inhibitor • p16 protegge l’ Rb dall’iperfosforilazione ed inattivazione da parte di cyclin D1/CDK4 • Quando p16 è mutato o deleto non è capace di eseguire questa funzione

**Alteration to the Retinoblastoma Pathway in Cancer • Oncogene cyclin D1 is a member of the cyclin gene family. • Cyclin D1 associates with kinase CDK4 (cyclin dependent kinase 4). Association causes activation of the kinase which is then capable of phosphorylating target substrates and allowing progression through the cell cycle. • Major substrate for cyclin D1/CDK4 is the retinoblastoma gene. Cyclin D1/CDK4 and retinoblastoma form a protein complex. Cyclin D1/CDK4 and cyclin E/CDK2 then sequentially phosphorylate Rb and causes Rb inactivation • Overexpression of cyclin D1 causes an equilibrium shift towards hyperphosphorylation of Rb and therefore inactivation of Rb resulting in deregulated progression through G1

Conclusioni Il Cancro è una malattia multifattoriale, fattori ambientali e genetici contribuiscono allo sviluppo dei tumori Alterazioni nei proto-oncogeni e nei geni oncosoppressori causano la predisposizione all’insorgenza di tumori. Ma non causano il cancro Lo sviluppo del cancro è un processo multifasico: Addizionali mutazioni sono necessarie affinché si possa sviluppare un tumore Possono essere necessari fino a 6-12 mutazioni per lo sviluppo del cancro I cambiamenti genici possono avvenire negli oncogeni, nei geni oncosoppressori, nei geni che regolano l’apoptosi che riparano il DNA e che controllano la differenziazione La predisposizione ereditaria avviene circa nel 15% dei tumori per mutazioni ereditarie in: Geni oncosoppressori Geni che riparano il DNA Raramente oncogeni

Oncogeni: Attivati da Mutazioni Dominanti (GOF) Oncosoppressori: Inattivati da Mutazioni Recessive (LOF) Una singola mutazione crea l’oncogene Cellula normale Mutazione attivante permette l’oncogene a stimolare la proliferazione cellulare Cellule proliferanti in modo abnorme La 2°mutazione Una mutazione Inattiva un gene oncosoppressore Inattiva un gene oncosoppressore Inattiva il gene oncosoppressore La mutazione di una singola copia del gene non ha effetto Cellula normale Due mutazioni inattivanti eliminano la funzionalmente il gene oncosoppressore, stimolando la proliferazione cellulare

Perdita di Eterozigosi La seconda mutazioneinattivante di una normale copia del gene può avvenire mediante alcuni meccanismi Loss of Heterozygosity (LOH) Second Mutation

La natura multifasica del cancro •Lo sviluppo del cancro è un processo multifasico che coinvolge 6-12 cambiamenti in geni regolatori. • Lo sviluppo del cancro dipende da alterazioni in vari pathways della trasduzione del segnale nella cellula. Esempio: il cancro Colon-rettale. • Lo sviluppo del cancro dipende dall’alterazione di molti geni in un pathway di transduzione. In molti casi queste alterazioni possono essere ridondanti.

Targets Trascrizionali di p53 Danno al DNA ATM/R Cdk4/6 cyclin D + Espressione di Geni in S-fase pRB inattiva E2F ATTIVO PCNA DNA pol a MDM2 p21 Arresto in G1 GADD45 p53 p53 Attivazione di p53 - incremento dei livelli di proteina - modificazione (Fosforilazione) BAX Inactivation of P53 Function • Mutation, deletion • Interaction with viral proteins: adenovirus E1B, SV40 large T, HPV E6 • Interaction with cellular oncogene MDM-2. Some human sarcomas show amplified MDM-2. MDM-2 binds to p53 and causes p53 degradation. MDM-2 activity can be inhibited by binding of tumor suppressor gene p14ARF. This function of p14ARF protects p53 and therefore stabilizes the protein FAS Apoptosi IGF-BP3

http://www.cineca.it/networking/streaming/sestri/courses/cancgen/Bernards.htm

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