Biologia, estrazione e utilità farmacologica delle Saponine DS - 2010

Le saponine: origine Glicosidi di origine vegetale Saponaria officinalis Hedera helix Aesculus hippocastanum Solanum tuberosum Immagini: internet

Le saponine: ruolo ecologico nei vegetali Non ancora precisamente definito Protezione contro erbivori (mammiferi, insetti), batteri e funghi Hanno un caratteristico gusto amaro e possono causere tossicità a lungo termine negli animali Permeabilizzano le pareti cellulari di animali e funghi Meccanismo battericida poco chiaro Riducono la digestione delle proteine Danneggiano la flora intestinale © TIBIO Sagl 2009 © TIBIO Sagl 2009

Le saponine: struttura chimica Formata da un aglicone (sapogenina) e residui zuccherini (1-11) Escina (maggiore glicoside presente nel composto) Gruppo triterpenico

Le saponine: protocollo d’estrazione In un pallone di vetro inserire: Droga polverizzata Soluzione etanolica 60%  solvente per estrarre le saponine Pietra pomice  permette un ebolilizione graduale del liquido, grazie all’aria che fuoriesce dai loro pori (ebollitori) Immagini: internet / Servier Medical Art

Le saponine: protocollo d’estrazione Solubilità delle saponine? Ruolo dell’etanolo 60%?

Le saponine: protocollo d’estrazione Sistema di estrazione: Refrigerante a serpentina Condensazione Estrazione dalla droga Pallone con soluzione alcolica e droga Molecole in soluzione Fonte di calore Immagini: Servier Medical Art Immagini: Servier Medical Art

Le saponine: protocollo d’estrazione Trasferire in una provetta e centrifugare: Sopranatante Saponine in soluzione Precipitato Droga esaurita Immagini: Servier Medical Art Immagini: Servier Medical Art

Le saponine: determinazione dell’attività emolitica Soluzione di eritrociti stabilizzata con EDTA: Chelatore EDTA Lega il calcio (Ca2+) Impedisce la coagulazione Immagini: Servier Medical Art

Le saponine: determinazione dell’attività emolitica Tampone fosfato 0.2 M pH 7.4 (250 mL) Scopo: creare una soluzione isosmotica a pH fisiologico Materiale: Fosfato di sodio: NaH2PO4 (sale dell’acido) MM: 120 g/mol – pKa2: 6.82 NaOH: base forte MM: 39.9 g/mol

Le saponine: determinazione dell’attività emolitica Tampone fosfato 0.2 M pH 7.4 (250 mL) Massa di NaH2PO4 : 0.2 M * 120 g/mol = 24 g/L = 6 g/250 mL Aggiungo un volume d’acqua minore di 250 mL Aggiusto il pH a 7.4 utilizzando NaOH 5 M 5 M * 39.9 g/moL = 199.5 g/L

Le saponine: determinazione dell’attività emolitica Tampone fosfato 0.2 M pH 7.4 (250 mL) Perché isotonico? Medesima pressione osmotica dei liquidi extracellulari e intracellulari (uguale [cationi] e [anioni]) Se liquido ipertonico? Se liquido ipotonico? Immagini: Servier Medical Art

Le saponine: determinazione dell’attività emolitica La membrana cellulare D.L. Nelson and M.M. Cox. Lehninger principles of biochemistry. Worth, New York, 5th edition, 2008.

Le saponine: determinazione dell’attività emolitica Composizione della membrana cellulare Fosfolipidi e trigliceridi D.L. Nelson and M.M. Cox. Lehninger principles of biochemistry. Worth, New York, 5th edition, 2008.

Le saponine: determinazione dell’attività emolitica Saponificazione della membrana Rottura dei legami idrofobi tra trigliceridi Formazione di micelle lipidiche (soluzione colloidale) D.L. Nelson and M.M. Cox. Lehninger principles of biochemistry. Worth, New York, 5th edition, 2008.

Le saponine: determinazione dell’attività emolitica Saponificazione della membrana, perché? Parte apolare Parte polare

Le saponine: determinazione dell’attività emolitica Affinità con il colesterolo Il colesterolo è un componente importante delle membrane animali, che da rigidità alla struttura della membrana Colesterolo Gruppo triterpenico della saponina (escina)

Le saponine: determinazione dell’attività emolitica Le saponine hanno una forte azione tensioattiva, solubilizzando i lipidi e danno origine a soluzioni colloidali di grassi in acqua Permeabilizzano le membrane degli eritrociti (pori di 40-50 Å) Permeabilizzano in generale le membrane lipidiche contenenti colesterolo

Le saponine: determinazione dell’attività emolitica Qualche definizione: Emolisi: lisi totale o parziale della membrana dei globuli rossi, con conseguente passaggio nel plasma dei componenti intracellulari Potere emolitico: capacità di una sostanza di lisare la membrana degli eritrociti (per rapporto ad uno standard, di solito un detergente)

Le saponine: determinazione dell’attività emolitica Protocollo sperimentale – diluzioni seriali: Saponina 0.1 g/L Escina 0.1 g/L Estratto idroalcolico di A. hippocastanum ? g/L diluito 1:2

Le saponine: determinazione dell’attività emolitica Protocollo sperimentale – diluzioni seriali: Contenuto in g/L di saponina (0.1 g/L) e escina (0.1 g/L)? Sol.1 Sol.2 Sol.3 Sol.4 Sol.5 Sol.11 Sol. 14 Standard 0.01 mL 0.05 mL 0.10 mL 0.15 mL 0.20 mL 0.70 mL 1.00 mL Tampone fosfato 0.99 mL 0.95 mL 0.90 mL 0.85 mL 0.80 mL 0.30 mL 0.00 mL Eritrociti Volume finale? 2.0 mL Standard in g ? 1*10-6 5*10-6 1*10-5 1.5*10-5 2*10-5 7*10-5 1*10-4 Sol.1 Sol.2 Sol.3 Sol.4 Sol.5 Sol.11 Sol. 14 Standard 0.01 mL 0.05 mL 0.10 mL 0.15 mL 0.20 mL 0.70 mL 1.00 mL Tampone fosfato 0.99 mL 0.95 mL 0.90 mL 0.85 mL 0.80 mL 0.30 mL 0.00 mL Eritrociti Volume finale? Standard in g ? Sol.1 Sol.2 Sol.3 Sol.4 Sol.5 Sol.11 Sol. 14 Standard 0.01 mL 0.05 mL 0.10 mL 0.15 mL 0.20 mL 0.70 mL 1.00 mL Tampone fosfato 0.99 mL 0.95 mL 0.90 mL 0.85 mL 0.80 mL 0.30 mL 0.00 mL Eritrociti Volume finale? 2.0 mL Standard in g ? Sol.1 : g di saponina? (0.01 mL / 1000 mL/L)*0.1 g/L = 1*10-6 g

Le saponine: determinazione dell’attività emolitica Protocollo sperimentale – attività emolitica: 1000 * (a/b) = attività emolitica per rapporto all’attività della saponina 1000 = attività emolitica della saponina a = quantità della saponina che provoca emolisi completa b = quantità della droga che provoca emolisi completa Come determinare l’emolisi? Nessna emolisi Emolisi completa Emolisi parziale Controllo

Le saponine: interesse farmacologico Le saponine sono state studiate per i loro effetti emolitici, con l’idea di essere utilizzate in caso di turbe cardiocircolatorie Non sono stati sviluppati medicamenti a base di saponine, a causa della troppo elevata tossicità

Le saponine: interesse farmacologico Al loro posto si usano le cumarine (corso A. Borsari) Dicumarina (Melilotus officinalis) Acenocumarolo (Sintrom ® Novartis Pharma) Fenprocumone (Marcoumar ® Meda Pharma)

Grazie per l’attenzione