Glicogenosi tipo 1a: trasferibilità dei dati sperimentali al trattamento del paziente Luigi Varesio AIG Rimini 2010

Dal laboratorio alla clinca Fase 1 Sperimentazione in vitro e su modelli animali preparazione dei reagenti per l’utilizzo sull’uomo Fase 2 Approvazione del protocollo dai comitati etici (Ospedale, Ministero della Sanità) Certificazione dei reagenti per sperimentazione sull’uomo Fase 3 Sperimentazione della terapia sul paziente

Terapia cellulare GSD1a Trapianto di epatociti

TRAPIANTO DI EPATOCITI MATURI Insufficienza epatica acuta Causa (N° pazienti trattati) outcome Droghe (19) 14 deceduti 2 trapiantati 3 guariti Infezione virale (9) 6 deceduti, due trapiantati, 1 guarito Insufficienza epatica acuta idiopatica (6) 2 deceduti, 3 trapiantati, 2 guariti Avvelenamento da funghi (1) Guarito Insufficienza epatica acuta idiopatica post-operatoria Deceduto

TRAPIANTO DI EPATOCITI MATURI Malattie Metaboliche malattia (N°pazienti) Risultati al follow up outcome Crigler-Najjar (9) Miglioramento dei parametri metabolici Tutti trapiantati (ecceto uno) da 4 mesi a 4 anni dal trattamento Ipercolesterolemia familiare (5) NA Deficienza del fattore VII (2) Riduzione della richiesta del fattore VII dell’70% per 6 mesi Trapianto dopo 7-8 mesi Glicogenosi tipo 1a Colestasi intraepatica familiare Nessun beneficio Trapianto dopo 5-14 mesi Deficienza di OTC (6) 4 pazienti con miglioramento dei parametri metabolici. 2 pazienti deceduti 4 pazienti trapiantati da 4 a 7 mesi dal trattamento Deficienza di ASL (1) Trapianto dopo 18 mesi Deficienza di CPS1 In attesa di trapianto dopo 11 mesi dal trattamento Citrullinemia

TERAPIA CELLULARE NEL FEGATO: STAMINALI Ben tollerate e poco invasive Sperimentazione nel topo

Terapia con staminali della glicogenosi 1a Modello di topo sano glicogenotico Terapia con staminali della glicogenosi 1a fegato ˜ Cellule staminali ematopoietiche Iniezione nel fegato di cellule staminali derivate dal midollo osseo

Ripopolazione del fegato con cellule staminali ematopoietiche ottenute da vari ceppi di topi a b c 20 mm topi Rosa-26 topi Rosa-26 topi Rosa-26 b-gal anti-b-gal controllo anti-b-gal d h f g e 2500 mm 100 mm a-GFP a-Alb Topi GFP Topi GFP Topi GFP Istochimica per attività G6Pasi FISH Fluorescenza GFP epatocita

Il trattamento con cellule staminali aumenta la sopravvivenza dei topi glicogenotici Non trattati Trattati v.t. Trattati i.f. Trattati i.e. % vivi Giorni dal trattamento

Trapianto di cellule ematopoietiche staminali CONCLUSIONI Cellule ematopoietiche staminali possono essere importanti per correggere i difetti enzimatici del fegato di pazienti con Glicogenosi di tipo 1a

CELLULE STAMINALI MIDOLLARI PER RIPOPOLAMENTO DEL FEGATO Cirrosi epatica Paese N° pazienti Tipo di cellule infuse Risultati ottenuti al follow-up follow-up (mesi) Italia 8 mobilitazione con G-CSF1 Miglioramento parametri clinici Giappone 9 Staminali derivate dal midollo 6 Iran 4 Staminali ematopoietiche derivate dal midollo Nessun miglioramento parametri clinici Staminali mesenchimali derivate dal midollo 12 Brasile 10 Mononucleate totali 30 3 Grecia 2 Inghilterra 5 CD34+ dopo adesione su plastica2 Germania CD133+ NA Germania3 13

I DIECI PRINCIPI DELLE GOOD MANUFACTURING PRACTICE LE NORMATIVE EUROPEE

Cell factory

LA GESTIONE DEL SISTEMA DI QUALITÀ Il personale -Le figure indispensabili: - Qualified Person - Responsabile Produzione -Responsabile Controllo Qualità La documentazione * La gestione della documentazione * Le standard operating procedures * I protocolli Il change control Le deviazioni Out of  specification e out of trend nei laboratori di controllo qualità La gestione delle azioni correttive e preventive I reclami ed i richiami Le auto ispezioni La certificazione dei lotti

LA PRODUZIONE Descrivere i flussi dei materiali in conformità alle normative GMP Descrivere i flussi di processo in conformità alle normative GMP Gli ambienti e le apparecchiature I sistemi di condizionamento Le utilities * Acqua * Vapore * Gas * ecc… La qualifica e le sue fasi La convalida di processo Il mantenimento dello stato di qualifica e convalida * Calibrazione * Manutenzione * Riqualifica

IL CONTROLLO QUALITÀ Ruoli e competenze Le attività di laboratorio * Metodi di analisi * La qualifica della strumentazione * La convalida dei metodi di analisi lL campionamento LE GESTIONE DELLE ATTIVITÀ A CONTRATTO Il “Technical/Quality Agreement” La qualifica del fornitore

La glicogenosi 1a può essere associata ad uno stato infiammatorio Necrotic foci, elevated chemokines and infiltrating neutrophils in the liver of glycogen storage disease type Ia. Kim DY et al, J Hepatol. 2008

Che cosa causa l’infiammazione? Glicogenosi tipo 1a Manifestazioni cliniche epatomegalia ipoglicemia iperuricemia iperlipidemia ritardi di crescita Complicazioni mancata crescita ritardo puberta’ gotta giovanile pancreatite arteriosclerosi epatoma ipertensione adenoma malattie renali Infiammazione zuccheri grassi proteine G6Pase Che cosa causa l’infiammazione? Citochine IL-6, IL-8

Il gene della sindrome Von Hippel Lindau (VHL) No VHL normale No G6Pasi normale

Hypoxia causes inflammation Years ago: 3.8 billion first procariotic fossil 2.0 billion photosynthetic organisms Oxygen captured by ferrous iron Earth “rusted” 1.8 billion first eucariotic organism Hypoxic Atmosphere (1% oxygen) 0.6 billion animal evolution Normoxic Atmosphere ( 20% oxygen) pathologic physiologic

x HIF-1 Pathway HRE NORMOXIA HYPOXIA No VHL P HIF-1a HIF-1b OH pVHL Ub Proteosomal degradation Ubiquitination NORMOXIA Prolyl- Hydroxylation HYPOXIA Stabilization HIF-1a P Hydroxylation HRE HIF-1b CBP/ p300 Transcription cofactors x No VHL

Hypoxia in patho-physiological processes Growing tumors Myocardial ischemia Cerebral ischemia Energy metabolism Diabetic retinopathy Pulmonary hypertension Cell survival Angiogenesis HYPOXIA (pO2 0-20mm Hg) Rheumatoid arthritis Wound healing Erytropoiesis Cell migration Cell proliferation/ survival Aherosclerosis Microbial infections Preeclampsia Intrauterine growth retardation

C’è ipossia nel fegato glicogenotico? Glicogenosi 1a C’è ipossia nel fegato glicogenotico?

Il mondo dell’ “omica”

The chip 54000 probsets

PROFILO DI ESPRESSIONE GENICA IN GSD1a Analisi tramite tecnologia microarray del: Profilo di espressione genica nel fegato di TRE pazienti GSD1a trapiantati rispetto a TRE soggetti normali Bibliosphere (Genomatics) nuovo programma per analizzare le vie metaboliche modificate nei tessuti

Ipossia nel fegato di pazienti con glicogenosi 1a NAME 23 GENI OXP HYPOXIA_REG_UP LINES_MYC_LEA NB-HYPO_32 GENES L1L2_11PBST HYPOXIA_RCC_NOVHL_UP L1L2_M- V$HIF1_Q3 HYPOXIA_NORMAL_UP HIF1_TARGETS L1L2_M+ TRP_U133 HYPOXIA_REVIEW V$HIF1_Q5 HYPOXIA_RCC_UP LEA_C1_SET_TOP NAME HSA00190_OXIDATIVE_PHOSPHORYLATION HSA00330_ARGININE_AND_PROLINE_METABOLISM HSA01040_POLYUNSATURATED_FATTY_ACID_BIOSYNTHESIS HSA00272_CYSTEINE_METABOLISM HSA00360_PHENYLALANINE_METABOLISM HSA00010_GLYCOLYSIS_AND_GLUCONEOGENESIS HSA00020_CITRATE_CYCLE HSA00910_NITROGEN_METABOLISM HSA00252_ALANINE_AND_ASPARTATE_METABOLISM HSA00030_PENTOSE_PHOSPHATE_PATHWAY HSA04610_COMPLEMENT_AND_COAGULATION_CASCADES HSA00220_UREA_CYCLE_AND_METABOLISM_OF_AMINO_GROUPS la glicogenosi 1a causa ipossia del fegato

Neutrophils recruitment Monocyte trapping Circulation Monocyte Hypoxic tissue O2 Neutrophils recruitment Monocyte trapping CXC-Chemokines ↑ CC-chemokine receptors ↓ Gro-chemokines ↑ Mn migration inhibiting factor (MIF) ↑ G-protein deactivator (RGS1) ↑ Motility-promoting factor (ENPP2) ↓

Che cosa provoca queste risposte? L’IPOSSIA DEL FEGATO Necrotic foci, elevated chemokines and infiltrating neutrophils in the liver of glycogen storage disease type Ia. Kim DY et al, J Hepatol. 2008

Che cosa causa l’infiammazione? Glicogenosi tipo 1a Manifestazioni cliniche epatomegalia ipoglicemia iperuricemia iperlipidemia ritardi di crescita Complicazioni mancata crescita ritardo puberta’ gotta giovanile pancreatite arteriosclerosi epatoma ipertensione adenoma malattie renali Infiammazione zuccheri grassi proteine G6Pase L’IPOSSIA DEL FEGATO Che cosa causa l’infiammazione? Citochine IL-6, IL-8

raccolta dei campioni e diffuione dei risultati Quali sono le criticità? BIOBANCHE!! raccolta dei campioni e diffuione dei risultati

Biobanca Integrata Tessuto-genomica (BIT) Gaslini Pazienti Dati clinici Trattamento Biobanca Raccolta tessuto Classificazione Patologia Diagnosi Raccolta , conservazione, Distribuzione tessuto Derivati del Tessuto Frazionament tessuto DNA, RNA, Proteine, distribuzione conservazione “omics” Arrays Strutture DNA Espressione Genica RNA regolatori Datti: centinaia di migliaia Integrazione Bioinformatica BANCA DATI Ricerca: Data mining Biomarcatori Vie Metaboliche BIT Clinica Fattori Prognostici Indicatori risposta

Biobanca Digitale Europea (DiBi) aggrega varie “BIT” Centralizzazione dell’informazione e non dei tessuti/sieri

Collaboratori Associazione Italiana Glicogenosi Reparti Clinici Biologia Molecolare Gaslini R. Lavieri A. Eva P. Fardin R.Resaz L. Varesio Reparti Clinici Dr. M. Di Rocco G.Gaslini Institute (Genova) Dr. D. Melis Federico II University (Napoli) Dr. R.Parini S.Gerardo Hospital (Monza) Dr. S. Paci S.Paolo Hospital (Milano) Dr. E. Procopio Meyer Hospital (Firenze) Dr. C. Dionisi Bambin Gesù Hospital (Roma) IST Genova O. Barbieri National Institutes of Health (USA) J.Chou D. Munroe S.K. Arya

Haematopoietic stem cells

Hematopoiesis in the red bone marrow

MODELLI ANIMALI PER GLICOGENOSI 1A In preparazione Modello animale Caratteristiche Costruttore Topi condizionali Knock-out (SV40-CRE) Chou, J. (pubblicato) Delezione della G6Pasi solo nel rene Chou, J. (nessuna informazione) Knock-out (CMV.CRE) Varesio. I knock-out muoiono tutti alla nascita Delezione della G6Pasi solo nel fegato Varesio. Stanno nascendo i primi topi ??? Fabienne RAJAS Gilles Mithieux. Nessuna informazione Nulla di pubblicato.

MODELLI ANIMALI PER GLICOGENOSI 1A Utilizzati finora Modello animale Tipo di terapia utilizzata Risultati Costruttore Topo knock-out Adenovirus Controllo parziale della patologia per breve tempo Chou, J. Adenovirus + adenoassociato Controllo parziale della patologia per medio tempo con miglioramento anche sul rene Adenoassociato di nuova costruzione Controllo completo della malattia Chou, J.2 Cane knock-out1 Modello animale spontaneo per la GSD-Ia. Adenoassociato Controllo parziale della patologia Koeberl DD (NC)3 Cane knock-out Mah CS (FL) 4 e Chou, J