Misurazione e uso di anticorpi Misurazione delle funzioni dei linfociti T

Misurazione e uso di Abs Saggio ELISA ELISPOT Cromatografia d’affinità Western Blotting Microscopia ad immunofluorescenza Citometria a flusso

Citometria a flusso

Basi della Citometria a Flusso Fluidica Cellule in sospensione passano in singola fila attraverso un volume illuminato dove esse riflettono/rifrattono la luce ed emettono fluorescenza che viene raccolta, filtrata e convertita ad un valore digitale che viene inviato al computer Ottica Schematizzazione dei principi principali su cui si basa la citometria a flusso Elettronica

Fluorocromi utilizzati più comunemente Linee Laser Comuni 600 nm 300 nm 500 nm 700 nm 400 nm 457 350 514 610 632 488 Coniugato PE-TR Texas Red Ioduro di Propidio Etidio Bromuro Sono rappresentati i comuni fluorocromi utilizzati in citometria. Le frecce indicano quelli di uso maggiore ed anche la lunghezza d’onda del laser maggiormente utilizzata (presente in pressochè tutti gli analizzatori). PE (ficoeritrina) FITC (fluoresceina) Acido cis- Parinarico

Schema generale della camera di flusso di un citofluorimetro Fluido di rivestimento Iniettore Cella di Flusso Granulocito Segnale di Fluorescenza Il primo momento della analisi citofluorimetrica è rappresentato dal passaggio delle cellule in sospensione attraverso il raggio laser, in fila. Nel caso sopra disegnato, viene analizzata una sospensione di globuli bianchi contente linfociti, monociti e granulociti. Linfocito Raggio laser focalizzato Monocito

Rilevamento dei parametri fisici Filtro Dicroico/Specchio a 45 gradi Sorgente luminosa Luce trasmessa Forward Scatter La luce trasmessa o riflessa dopo il passaggio delle cellule attraverso il laser viene raccolta e dà le prime informazioni sui parametri fisici della popolazione in esame Luce Riflessa Side Scatter

(Forward Angle Light Scatter, FALS) Scatter frontale (Forward Angle Light Scatter, FALS) Granulocito Laser Sensore per il FALS Il semplice passaggio delle cellule attraverso il laser dà origine ad un segnale che viene captato dal sensore che raccoglie la luce dello scatter frontale (forward), e che dà informazioni sul volume cellulare. Linfocito Monocito

Quando viene utilizzata una sorgente laser, la quantità di luce “scatterata” nella direzione frontale (ovvero lungo lo stesso asse attraverso cui viaggia la luce laser) viene raccolta nel canale del forward scatter L’ intensità del forward scatter è proporzionale alla dimensione, forma ed omogeneità ottica delle cellule (o delle altre particelle analizzate)

Scatter laterale (90 Degree Light Scatter) Sensore per il 90°LS Granulocito Linfocito Sensore FALS Sensore per il 90°LS Laser Il passaggio delle cellule dà anche origine ad un secondo segnale che viene captato dal sensore che raccoglie la luce dello scatter laterale, a 90 gradi (side angle oppure 90 degree scatter), e che dà informazioni sulla densità/granularità (compreso il rapporto nucleo/citoplasma) delle cellule che passano attraverso il laser. Monocito

Quando si utilizza una sorgente laser, la quantità di luce “scatterata” lateralmente (perpendicolare all’asse attraverso cui viaggia la luce laser) viene raccolta nel canale del side oppure 90°scatter Anche l’ intensità del side scatter è proporzionale alla dimensione, forma ed omogeneità ottica delle cellule (o delle altre particelle analizzate)

può essere usato per distinguere cellule vive da cellule morte Il Forward Scatter tende ad essere più sensibile alle proprietà della superficie cellulare delle particelle del Side Scatter può essere usato per distinguere cellule vive da cellule morte Il Side Scatter tende ad essere più sensibie alle inclusioni presenti all’interno della cellula del forward scatter può essere usato per distinguere cellule granulate da cellule non-granulate Proprietà tipiche del forward e del side scatter

Esempio di analisi dei leucociti e “gating” elettronico GRANULOCITI 90 Degree Scatter MONOCITI Analisi citofluorimetrica dei leucociti del sangue periferico. Si noti come si possono facilmente identificare tre popolazioni, ovvero i linfociti, monociti e granulociti, d eventualmente disegnarci intorno un “gate” elettronico che permetterà in seguito l’analisi del segnale di fluorescenza proveniente soltanto dalla popolzione scelta. LINFOCITI Forward Scatter

Nuclei di linfociti normali o apoptotici 90 Degree Scatter Lo studio dei parametri fisici applicato a nuclei isolati (provenienti da cellule trattate con una soluzione ipotonica) permette anche di discriminare immediatamente cellule normali da cellule apoptotiche, i cui nuclei sono infatti condensati e raggrinziti, ovvero diminuiscono il FSC ed aumentano il SSC. Forward Scatter

Complex or Boolean Gating With two overlapping regions, several options are available: R1 R2

Boolean Gating Region 1 and Region 2:

Analisi citofluorimetrica DC CD11c+ CD11b+ pDC CD11c+ CD11b- FL2-H Macrophages CD11c- CD11b+ T cells CD11c- CD11b- B cells FL1-H FL1-H : CD11b FL2-H : CD11c

Analisi del ciclo cellulare

…

apoptosi

analisi al citofluorimetro

. singole

Il “sorting” cellulare

- + FACS: Fluorescence Activated Cell Sorting FALS Sensor Fluorescence 488 nm laser FALS Sensor FACS: Fluorescence Activated Cell Sorting Fluorescence detector - + Piastre cariche elettricamente Gli strumenti più complessi consentono anche il recupero della popolazione analizzata, ovvero il “sorting” cellulare. Cellule singole separate dentro diverse provette

Jet-in-Air Optics Electronic Electrode Crystal Nozzle Freq. (Hz) Laser Amp. (v)

Jet-in-Air Nozzle Freq. (Hz) Laser Optics Electronic Amp. (v) Electrode Crystal Nozzle Freq. (Hz) Laser Optics Electronic Amp. (v)

Jet-in-Air +++++++++ +/- 190 V Nozzle Freq. (Hz) Laser Fluorescence Electrode Crystal Nozzle +++++++++ Freq. (Hz) Laser Fluorescence Optics Electronic Delay Time Break-off Point Amp. (v)

Jet-in-Air + _ - 3000 V + 3000 V

Macrofagi peritoneali CD11b positivi Analisi pre-sorter Macrofagi peritoneali CD11b positivi

Macrofagi peritoneali CD11b positivi Gating Macrofagi peritoneali CD11b positivi

Sorted CD11b HIGH sorted CD11b INT. sorted

Misurazione e uso di Abs Saggio ELISA ELISPOT Cromatografia d’affinità Western Blotting Microscopia ad immunofluorescenza Citometria a flusso

ELISA Legame diretto con l’Ag Sandwich

ELISA sandwich

ELISPOT

Western blotting

Cromatografia d’affinità

Magnetic sorting

miniMACS

Microscopia ad immunofluorescenza .

Immuno Staining (anti-occludina) polilisina/vetrino conc. finale di Poli-L. 0,5 mg/ml, in H2O 20 min. RT 2 lavaggi con H2O asciugare bene PREPARZIONE DEI CAMPIONI Seminare 1,5 x 105 cells/vetrino, in 70 µl di terreno NO siero Incubazione, 15 min 37ｰC (incubatore) Controllare al microscopio FISSARE LE CELLS Aspirare il surnatante Aggiungere 70 µl di PFA1%, 60 min a 4ｰC Lavare tre volte con PBS 1X (RT) A questo passaggio posso conservare i campioni (in PBS, 4ｰC) 1 COLORAZIONE Aspirare il PBS Permeare, 0,05%TRITON X-100 in PBS, 5 min on ice. Washing 3X con PBS Blocking con 3%BSA in PBS, 15 min RT Washing 3x con PBS Primary Ab, anti-occludina (rabbit, 1 mg/ml, ZYMED, cat. N. 71.1500), usare 10 µg/ml finale in BSA 0,5% in PBS. Centrifugare 3 min a 3000 rpm. 70 µl/vetrino 1 h on ice Secondary Ab, a-rabbit, IgG, Cy3-conjugated (donkey Jackson Cod. n. 711.166.152). Suggested dilution 1:700, in BSA 0,5% in PBS. Centrifugare 3 min a 3000 rpm. 70 µl/vetrino. 30 min on ice, al buio. Montare il vetrino (coverslip) su portaoggetti usando 5-6 µl di moviol 30 min RT, buio Vetrino a – 20ｰC. 2

Misurazione delle funzioni dei linfociti T A differenza della misurazione della risposta anticorpale umorale, l’immunità mediata dalle cells T è tecnicamente più difficile da misurare. Le cells T non secernono prodotti in grado di legare l’antigene, per cui non esiste per questo tipo di risposta nessun semplice saggio di legame

Studio di funzioni linfocitarie Le funzioni del linfociti T possono essere misurate in 3 modi: Uccisione del bersaglio cellulare Attivazione delle cellule APC Produzione di citochine

Metodiche saggio di citotossicità saggio di proliferazione misurazione di citochine

Attività citotossica: Rilascio di cromo da cellule bersaglio

Proliferazione antigene-specifica delle cellule T

Misura citochine prodotte: intracellular staining

Intracellular staining 8- lavare con 2 ml di PBS-FCS 5% 9- permeare: risospendere le cells in 500 l PB (PBS+FCS 5%+0.5% saponina). 10 min RT 10- aggiungere 1 ml PB e centrifugare 1200 rpm x 5 min 11- risospendere in 100 l di PB+siero per blocking (1:25) 12- aggiungere anticorpo intracellulare 13- incubare 30 min RT al buio 14- lavare 2 volte con PB 15- lavare 2 volte con PBS-FCS 5% 1- cellule in piastra a concentrazione molto alta (5x105cells/ml) 2- aggiungere Brefaldine (BFA) 10 µg/ml 3- raccogliere le cellule e suddividerle nei tubi (1-1,5x106cells/ml/sample) 4- blocking: incubare 100 l di PBS-FCS 5% 10 min RT 5- aggiungere anticorpo di superficie 6- lavare 4 volte con 2 ml PBS-FCS 5% 7- fissare con 500 l/tubo di paraformaldeide 2% e incubare 10 minuti RT

Misura citochine prodotte: cytokine capture

CFSE 5- or 6-(N-Succiimidyloxycarbonyl)-3',6'-O,O'-diacethylfluorescein CFSE is cell membrane permeable and readily accumulates inside of viable cells where it covalently attaches to intracellular proteins. Hydrolyzed CFSE emits fluorescence and covalently-attached fluorescein molecules seldom leak from cells. CFSE-labeled cells can be monitored over several weeks in vivo. Therefore, CFSE is utilized for viable cell detection as well as for the long-term observation of cell activities by fluorescent microscopy. The excitation and emission wavelengths of CFSE-labeled cells are 500 nm and 520 nm, respectively.

T cell proliferation CFSE staining

Allogeneic CD8 T cell proliferation . Allogeneic CD8 T cell proliferation CD8 No DCs WT IL-2-/- 48 h CFSE 72 h FSC