Misurazione e uso di Abs

Presentazione sul tema: "Misurazione e uso di Abs"— Transcript della presentazione:

1 Misurazione e uso di anticorpi Misurazione delle funzioni dei linfociti T

2 Misurazione e uso di Abs
Saggio ELISA ELISPOT Cromatografia d’affinità Western Blotting Microscopia ad immunofluorescenza Citometria a flusso

3 Citometria a flusso E’ una tecnica che permette la misurazione e la caratterizzazione di cellule sospese in un mezzo fluido. Rende possibile la misurazione di proprietà multiple di singole cells ad una velocità molto rapida, permettendo una dettagliata analisi qualitativa e quntitativa

4 Un po’ di storia La comparsa della citofluorimetria a flusso (CFM) avviene intorno agli anni ‘70, determinando un veloce ed intenso sviluppo delle tecniche istologiche e citochimiche. Inizialmente limitata alla misura di 1-2 parametri, portò grande impulso allo studio del sistema immunitario, grazie all’utilizzo di Ab monoclonali marcati con fluorescina (FITC)

5 … La complessità del sistema immunitario e la presenza di diverse sub-popolazioni che reagivano con lo stesso Ab stimolarono: lo sviluppo di MoAb sempre più specifici; la ricerca di nuovi coloranti fluorescenti da coniugare agli Ab la creazione di citofluorimetri a flusso multiparametrici

6 Applicazioni Studio della proliferazione cellulare
Analisi del ciclo cellulare Analisi innunofenotipica multiparametrica Risposta del sistema immunitario Studio dei livelli di apoptosi

7 Vantaggi analisi multiparametrica elevato numero di cells esaminate
rapidità dei tempi di analisi (1000 cells/s) obiettività, riproducibilità e affidabilità statistica delle letture campioni processati senza perdere la vitalità cellulare

8 Limiti analisi di cells molto rare, che a causa del loro ridotto numero in confronto agli eventi analizzati potrebbero essere difficilmente separabili dal “rumore di fondo” necessità di dover lavorare con campini in fase monodispersa

9 Principi di funzionamento

10 Basi della Citometria a Flusso
Fluidica Cellule in sospensione passano in singola fila attraverso un volume illuminato dove esse riflettono/rifrattono la luce ed emettono fluorescenza che viene raccolta, filtrata e convertita ad un valore digitale che viene inviato al computer Ottica Schematizzazione dei principi principali su cui si basa la citometria a flusso Elettronica

11 Fluorocromi utilizzati più comunemente
Linee Laser Comuni 600 nm 300 nm 500 nm 700 nm 400 nm 457 350 514 610 632 488 Coniugato PE-TR Texas Red Ioduro di Propidio Etidio Bromuro Sono rappresentati i comuni fluorocromi utilizzati in citometria. Le frecce indicano quelli di uso maggiore ed anche la lunghezza d’onda del laser maggiormente utilizzata (presente in pressochè tutti gli analizzatori). PE (ficoeritrina) FITC (fluoresceina) Acido cis- Parinarico

12 Schema generale della camera di flusso di un citofluorimetro
Fluido di rivestimento Iniettore Cella di Flusso Granulocito Segnale di Fluorescenza Il primo momento della analisi citofluorimetrica è rappresentato dal passaggio delle cellule in sospensione attraverso il raggio laser, in fila. Nel caso sopra disegnato, viene analizzata una sospensione di globuli bianchi contente linfociti, monociti e granulociti. Linfocito Raggio laser focalizzato Monocito

13 Rilevamento dei parametri fisici
Filtro Dicroico/Specchio a 45 gradi Sorgente luminosa Luce trasmessa Forward Scatter La luce trasmessa o riflessa dopo il passaggio delle cellule attraverso il laser viene raccolta e dà le prime informazioni sui parametri fisici della popolazione in esame Luce Riflessa Side Scatter

14 (Forward Angle Light Scatter, FALS) luce dispersa in avanti
Scatter frontale (Forward Angle Light Scatter, FALS) luce dispersa in avanti Granulocito Laser Sensore per il FALS Il semplice passaggio delle cellule attraverso il laser dà origine ad un segnale che viene captato dal sensore che raccoglie la luce dello scatter frontale (forward), e che dà informazioni sul volume cellulare. Linfocito Monocito

15 Quando viene utilizzata una sorgente laser, la quantità di luce “scatterata” nella direzione frontale (ovvero lungo lo stesso asse attraverso cui viaggia la luce laser) viene raccolta nel canale del forward scatter la luce dispersa in avanti (forward scatter) e’ legata alle dimensioni delle cellule

16 Scatter laterale (90 Degree Light Scatter o Side Scatter) Granulocito
luce riflessa Granulocito Linfocito Sensore Laser Il passaggio delle cellule dà anche origine ad un secondo segnale che viene captato dal sensore che raccoglie la luce dello scatter laterale, a 90 gradi (side angle oppure 90 degree scatter), e che dà informazioni sulla densità/granularità (compreso il rapporto nucleo/citoplasma) delle cellule che passano attraverso il laser. Monocito

17 Quando si utilizza una sorgente laser, la quantità di luce “scatterata” lateralmente (perpendicolare all’asse attraverso cui viaggia la luce laser) viene raccolta nel canale del side scatter luce riflessa (side scatter) e’ da attribuire a parametri della morfologia cellulare come la granulosita’ del citoplasma, il rapporto nucleo/citoplasma, la rugosita’ di superficie.

18 Il Forward Scatter tende ad essere più sensibile alle proprietà della superficie cellulare
può essere usato per distinguere cellule da: vive/morte, piccole/grandi Il Side Scatter tende ad essere più sensibie alle inclusioni presenti all’interno della cellula può essere usato per distinguere cellule granulate da cellule non-granulate Proprietà tipiche del forward e del side scatter

19 Forward Scatter Detector
LASER Side Scatter Detector (cellular complexity) Forward Scatter Detector (size) Adattato da University of Arkansas for Medical Sciences

20 Elaborazione e Rappresentazione dei dati
L’elaborazione dei dati e’ eseguita grazie al computer collegato allo strumento, che tramite specifici software provvede a tradurre i segnali in grafici e alla loro rappresentazione su display video in tempo reale.

21 Componenti di un CFM

22 Sorgenti laser La sorgente ad Ar ha un costo relativamente elevato e permette l’emissione ad un ridotto numero di lunghezze d’onda: 514, 488 e 345 nm. Altri tipi di sorgenti laser sono impiegate in citometria a flusso: Kripton Elio Neon

23 Fluorocromi utilizzati più comunemente
Linee Laser Comuni 600 nm 300 nm 500 nm 700 nm 400 nm 457 350 514 610 632 488 Coniugato PE-TR Texas Red Ioduro di Propidio Etidio Bromuro Sono rappresentati i comuni fluorocromi utilizzati in citometria. Le frecce indicano quelli di uso maggiore ed anche la lunghezza d’onda del laser maggiormente utilizzata (presente in pressochè tutti gli analizzatori). PE (ficoeritrina) FITC (fluoresceina) Acido cis- Parinarico

24 riepilogo Computer Elettronica Fluidica Laser Light 488nm
Diffusione Forward scatter Diffusione a 90° Side scatter Fluorescenza Elettronica Light detectors FL3 PerCP, Cy5 Fluidica FL2 PE Computer FL1 FITC Laser Light 488nm SSC FSC

25

26

27 Rappresentazione dei dati
Esistono diversi modi per rappresentare un dato citofluorimetico. Tra i più semplici abbiamo: citogramma istogramma

28 Citogramma Dot-plot diagramma bidimensionale ottenuto dalla combinazione del forward e del side scatter. Permette di discriminare tra diverse popolazioni cellulari basandosi solamente sulle loro caratteristiche fisiche. Le rappresentazioni bidimensionali, permettono di mettere in correlazione due parametri tra di loro.

29

30 Analisi citofluorimetrica
DC CD11c+ CD11b+ pDC CD11c+ CD11b- FL2-H Macrophages CD11c- CD11b+ T cells CD11c- CD11b- B cells FL1-H FL1-H : CD11b FL2-H : CD11c

31 Esempio di analisi dei leucociti e “gating” elettronico
GRANULOCITI Side Scatter MONOCITI Analisi citofluorimetrica dei leucociti del sangue periferico. Si noti come si possono facilmente identificare tre popolazioni, ovvero i linfociti, monociti e granulociti, d eventualmente disegnarci intorno un “gate” elettronico che permetterà in seguito l’analisi del segnale di fluorescenza proveniente soltanto dalla popolzione scelta. LINFOCITI Forward Scatter

32 Nuclei di linfociti normali o apoptotici
90 Degree Scatter Lo studio dei parametri fisici applicato a nuclei isolati (provenienti da cellule trattate con una soluzione ipotonica) permette anche di discriminare immediatamente cellule normali da cellule apoptotiche, i cui nuclei sono infatti condensati e raggrinziti, ovvero diminuiscono il FSC ed aumentano il SSC. Forward Scatter

33 Gating

34 Istogramma L’ascissa riporta l’intensita’ di fluorescenza e l’ordinata il numero di cellule che esprimono o meno l’antigene (diagramma di distribuzione).

35 Analisi statistica Si basa sull’impostazione di cursori che delimitano le aree di interesse, e sulla quantificazione degli eventi cellulari che rientrano in tali aree. Per ogni picco e’ possibile calcolare dati statistici (valore medio, deviazione standard, coefficiente di variazione, ecc)

36 quadranti

37 …

38 Analisi del ciclo cellulare

39 Fluorocromi utilizzati più comunemente
Linee Laser Comuni 600 nm 300 nm 500 nm 700 nm 400 nm 457 350 514 610 632 488 Coniugato PE-TR Texas Red Ioduro di Propidio Etidio Bromuro Sono rappresentati i comuni fluorocromi utilizzati in citometria. Le frecce indicano quelli di uso maggiore ed anche la lunghezza d’onda del laser maggiormente utilizzata (presente in pressochè tutti gli analizzatori). PE (ficoeritrina) FITC (fluoresceina) Acido cis- Parinarico

40 apoptosi

41

42 . singole

43 Il “sorting” cellulare

44 - + FACS: Fluorescence Activated Cell Sorting FALS Sensor Fluorescence
488 nm laser FALS Sensor FACS: Fluorescence Activated Cell Sorting Fluorescence detector - + Piastre cariche elettricamente Gli strumenti più complessi consentono anche il recupero della popolazione analizzata, ovvero il “sorting” cellulare. Cellule singole separate dentro diverse provette

45

46 Jet-in-Air Optics Electronic Electrode Crystal Nozzle Freq. (Hz) Laser
Amp. (v)

47 Jet-in-Air Nozzle Freq. (Hz) Laser Optics Electronic Amp. (v)
Electrode Crystal Nozzle Freq. (Hz) Laser Optics Electronic Amp. (v)

48 Jet-in-Air +++++++++ +/- 190 V Nozzle Freq. (Hz) Laser Fluorescence
Electrode Crystal Nozzle Freq. (Hz) Laser Fluorescence Optics Electronic Delay Time Break-off Point Amp. (v)

49 Jet-in-Air + _ V V

50 Macrofagi peritoneali CD11b positivi
Analisi pre-sorter Macrofagi peritoneali CD11b positivi

51 Macrofagi peritoneali CD11b positivi
Gating Macrofagi peritoneali CD11b positivi

52 Sorted CD11b HIGH sorted CD11b INT. sorted

53 Misurazione e uso di Abs
Saggio ELISA ELISPOT Cromatografia d’affinità Western Blotting Microscopia ad immunofluorescenza Citometria a flusso

54 ELISA Legame diretto con l’Ag Sandwich

55 ELISA sandwich

56 ELISPOT

57 Western blotting

58 Cromatografia d’affinità

59 Magnetic sorting

60 Dynabeads® from Invitrogen
Magnetic sorting Dynabeads® from Invitrogen MACS® from Miltenyi 60

61 Beads 61

62 Beads 62

63 principio generale prima fase di incubazione cells+ab lavaggio
eluizione raccolta

64 Marcatura La marcatura può essere diretta quando l’anticorpo, specifico per un marker di superficie cellulare, è direttamente coniugato alla particella magnetica; oppure indiretta quando le cells vengono marcate con un ab primario biotinilato poi riconosciuto da un ab secondario anti-biotina coniugato alla biglia 64

65 65

66 Selezione positiva Selezione negativa 66

67 miniMACS

68 Microscopia ad immunofluorescenza
.

69 Immuno Staining (anti-occludina)
polilisina/vetrino conc. finale di Poli-L. 0,5 mg/ml, in H2O 20 min. RT 2 lavaggi con H2O asciugare bene PREPARZIONE DEI CAMPIONI Seminare 1,5 x 105 cells/vetrino, in 70 µl di terreno NO siero Incubazione, 15 min 37ｰC (incubatore) Controllare al microscopio FISSARE LE CELLS Aspirare il surnatante Aggiungere 70 µl di PFA1%, 60 min a 4ｰC Lavare tre volte con PBS 1X (RT) A questo passaggio posso conservare i campioni (in PBS, 4ｰC) 1 COLORAZIONE Aspirare il PBS Permeare, 0,05%TRITON X-100 in PBS, 5 min on ice. Washing 3X con PBS Blocking con 3%BSA in PBS, 15 min RT Washing 3x con PBS Primary Ab, anti-occludina (rabbit, 1 mg/ml, ZYMED, cat. N ), usare 10 µg/ml finale in BSA 0,5% in PBS. Centrifugare 3 min a 3000 rpm. 70 µl/vetrino 1 h on ice Secondary Ab, a-rabbit, IgG, Cy3-conjugated (donkey Jackson Cod. n ). Suggested dilution 1:700, in BSA 0,5% in PBS. Centrifugare 3 min a 3000 rpm. 70 µl/vetrino. 30 min on ice, al buio. Montare il vetrino (coverslip) su portaoggetti usando 5-6 µl di moviol 30 min RT, buio Vetrino a – 20ｰC. 2

70

71

72

73

74 Misurazione delle funzioni dei linfociti T
A differenza della misurazione della risposta anticorpale umorale, l’immunità mediata dalle cells T è tecnicamente più difficile da misurare. Le cells T non secernono prodotti in grado di legare l’antigene, per cui non esiste per questo tipo di risposta nessun semplice saggio di legame

75 Studio di funzioni linfocitarie
Le funzioni del linfociti T possono essere misurate in 3 modi: Uccisione del bersaglio cellulare Attivazione delle cellule APC Produzione di citochine

76 Metodiche saggio di citotossicità saggio di proliferazione
misurazione di citochine

77 Attività citotossica: Rilascio di cromo da cellule bersaglio

78 Proliferazione antigene-specifica delle cellule T

79 Misura citochine prodotte: intracellular staining

80 Intracellular staining
8- lavare con 2 ml di PBS-FCS 5% 9- permeare: risospendere le cells in 500 l PB (PBS+FCS 5%+0.5% saponina). 10 min RT 10- aggiungere 1 ml PB e centrifugare 1200 rpm x 5 min 11- risospendere in 100 l di PB+siero per blocking (1:25) 12- aggiungere anticorpo intracellulare 13- incubare 30 min RT al buio 14- lavare 2 volte con PB 15- lavare 2 volte con PBS-FCS 5% 1- cellule in piastra a concentrazione molto alta (5x105cells/ml) 2- aggiungere Brefaldine (BFA) 10 µg/ml 3- raccogliere le cellule e suddividerle nei tubi (1-1,5x106cells/ml/sample) 4- blocking: incubare 100 l di PBS-FCS 5% 10 min RT 5- aggiungere anticorpo di superficie 6- lavare 4 volte con 2 ml PBS-FCS 5% 7- fissare con 500 l/tubo di paraformaldeide 2% e incubare 10 minuti RT

81