Principi e basi della diagnostica virologica A.Azzi, Firenze 19.11.2004

L’importanza della diagnosi Esclusione di altre cause Impiego di terapie antivirali Nella prevenzione Diagnosi precoce Diagnosi rapida

Approcci diagnostici Manifestazioni cliniche Diagnosi indiretta (sierologica) Sieroconversione Aumento del titolo Presenza di IgM specifiche Avidità delle IgG Diagnosi diretta Ricerca del virus (o di sue componenti) Il rischio infettivo in ambito trasfusionale

Il sig ZZ ha una infezione da HIV Diagnosi sierologica Risultato ricerca di anticorpi anti HIV nel cs (03/03/03) del Sig ZZ: positivo Il sig ZZ ha una infezione da HIV

Diagnosi sierologica Il sig XY gode di ottima salute !!! Risultato ricerca di anticorpi anti HIV nel cs (04/04/04) del Sig XY: negativo Risultato ricerca di anticorpi anti-HBsAg nel cs (04/04/04) del Sig XY: negativo Risultato ricerca di anticorpi anti HCV nel cs (04/04/04) del Sig XY: IgM neg, IgG pos

Diagnosi indiretta: limiti Malattie causate da: riattivazione di virus latenti o infezioni persistenti In: pazienti immunodepressi Disponibilità dei campioni

La ricerca del virus

La ricerca del virus L’isolamento Nelle colture cellulari Nell’aminale Nelle uova embrionate Nelle colture cellulari

Isolamento nelle colture cellulari Effetti dello sviluppo del virus ECP (+/- specifico) Emoadsorbimento ………………… Necessità di test identificazione del virus: neutralizzazione, IEA, IF …………..

Effetti citopatici da virus Morte cellulare Arrotondamento Degenerazione Aggregazione Perdita di adesione al substrato Cambiamenti istologici caratteristici: inclusioni nucleari o citoplasmatiche Formazione di sincizi Cambiamenti della superficie cellulare: espressione di antigeni virali emoadsorbimento

Problemi nell’impiego delle colture cellulari Tempi lunghi per comparsa ECP Determinanti le condizioni di conservazione del campione. Possibii contaminazioni batteriche e fungine. Sostanza tossiche presenti nel campione. Molti virus non crescono nelle colture cellulari e.g. Hepatitis B, Diarrhoeal viruses, parvovirus, papillomavirus.

Test rapidi Ricerca di Ag dei virus influenzali A e B Test immunoenzimatico (ELISA) Supporto: membrana di nitrocellulosa Ab monoclonali specifici per la NP virale Campioni: lavaggi e aspirati nasofaringei, TF Tempo: 15 minuti Distinzione dei tipi (A-B)

La ricerca di componenti del virus nel campione clinico Antigeni virali Nel siero: antigeni solubili Nelle cellule : antigeni di superficie o intracellulari Acido nucleico virale Tecniche di amplificazione …. ma non solo HBsAg, HBeAg p24 Tecniche di immunoprecipitazione immunoenzimatiche Tecniche quantitative nel monitoraggio dell’infezione e della terapia Analisi delle sequenze per la determinazione delle resistenze, per la genotipizzazione, per l’epidemiologia Immunofluorescenza immunoistochimica

Limiti tecniche “tradizionali” EM/IEM Isolamento Ricerca antigeni Virus non coltivabili Scarsamente visualizzabili Agentisconosciuti Costi Manualità Tempi Sensibilità Difficoltà di individuare antigeni (HCV,TTV…)

Tecniche di ibridazione Impiego prevalente per rivelazione e conferma specifictà prodotti di amplificazione Ibridazione in situ Nuove versioni

Quali tecniche di amplificazione Amplificazione della sequenza bersaglio Amplificazione del segnale Amplificazione della sonda Applicazioni qualitative e quantitative Non solo PCR

Per quali esigenze: per virus non coltivabili o coltivabili con difficoltà a lento sviluppo - effetto per virus “ad alto rischio” per la ricerca di virus nel liquor o comunque in campioni in cui la carica virale sia bassa Virus epatite B e C Papillomavirus Parvovirus B19, TTV

Impiego delle tecniche di biologia molecolare nella diagnostica virologica Applicazioni quantitative per distinzione tra infezione latente e infezione attiva (riattivazione) monitoraggio infezione (prognosi) monitoraggio terapia valutazione del rischio di trasmissione

La ricerca di componenti del virus nel campione clinico Antigeni virali Acido nucleico virale Sensibilità + Specificità +++ Rapidità ++++ Sensibilità +++ Specificità +++ Rapidità ++

L’interpretazione L’immunodepressione Infezioni virali latenti e infezioni virali persistenti Infezioni subcliniche Può rendere poco attendibili i risultati della sierologia L’uso di tecniche molto sensibili rende Necessario riconsiderare il valore diagnostico di un risultato positivo

I marcatori sierologici dell’HCV nel periodo seguente all’infezione Infection Infezione HCV RNA 1 2 EIA 3.0 EIA 2.0 3 EIA 1.0 4 13 70 80 150 (giorni) 150 Ortho-Clinical Diagnostics

Nuovi sviluppi L’analisi delle sequenze nella diagnostica virologica Genotipizzazione Nuove tecnologie Amplificazione real time Microarray Pyrosequencing