Cosa sono e cosa servono gli allergeni e gli epitopi ricombinanti nella diagnosi di allergia alimentare Dott. Alberto Martelli Melloni Pediatria Milano Milano 1 Febbraio 2008

Variabilità degli estratti per prick e RAST Estratti di fonti diverse, pur se definiti allo stesso modo possono contenere miscele di proteine qualitativamente e quantitativamente molto diverse tra loro, il che ovviamente condiziona molto l’esito dei test Quando noi eseguiamo un prick o un RAST ad un alimento testiamo una miscela di proteine, non la singola proteina. Esistono poche eccezioni : ad esempio se facciamo il RAST per la Beta lattoglobulina andiamo a ricercare le IgE dirette contro un’unica proteina ma se facciamo il RAST per uovo, mela, carota o altri cerchiamo le igE prodotte contro una miscela di proteine di quell’alimento. Differenze fra case produttrici diverse Lotti della stessa casa produttrice possono avere concentrazioni differenti di allergene Grier TJ et al. Allergy Asthma Proc 2002;23:125-31. Dolen WK. Ann Allergy Asthma Immunol 1995;75:81-2.

Come si ottengono gli allergeni? L’estrazione e la purificazione Gli allergeni possono essere proteine solubili e glicoproteine. Le strategie utilizzate per la loro purificazione sono le stesse di quelle adottate per la purificazione delle proteine in generale. Il primo passo consiste nell'estrarre dal materiale grezzo la massima quantità di allergene, con la minima degradazione o denaturazione possibile. Si é cercato di istituire delle procedure, non solo rivolte alla ricerca, che potessero su larga scala identificare le IgE verso le singole proteine. Per poter far questo bisognava avere delle proteine uguali a quelle naturali. Come si fa ad identificare ed estrarre un allergene?. Le tecniche sono 3 e possono anche essere combinate. Occorre ottenerne la massima quantità possibile senza denaturarlo Scheurer S. Clin Exp Allergy 2006;36:1483-6.

Tecniche per identificazione dell’allergene L'identificazione e la caratterizzazione degli allergeni avviene per mezzo di tecniche immunochimiche, biochimiche e di biologia molecolare. I metodi più comunemente usati sono: - la immunoelettroforesi migrazione elettroforetica con Ab specifici - la SDS - PAGE (sodium dodecyl sulphate - polyacrylamide gel electrophoresis): peso molecolare l'isoelettrofocalizzazione (IEF), in associazione con tecniche di immunoblotting: punto isoelettrico (è il valore di pH al quale una molecola non reca alcuna carica elettrica netta). Per alcune limitazioni di queste tecniche, spesso si rende necessario l'impiego contemporaneo di più metodi per poter giungere a risultati definitivi.   I diversi allergeni possono essere ottenuti per estrazione e purificazione dalla fonte oppure come allergeni ricombinanti ottenuti da cDNA prodotto da RNA messaggero dell’allergene mediante trascrittasi inversa.

SDS page Actinidina é estratta dal frutto acerbo del Kiwi. La maggior parte degli allergeni alimentari sono proteine o glicoproteine con peso molecolare variabile tra 5-70 kDa.

Isoelettrofocalizzazione La maggioranza di essi ha un punto isoelettrico compreso tra 4 e 7, e sono in gran parte di natura cationica. Le piccole variazioni del peso molecolare e della carica possono essere spiegate con l'esistenza di diverse forme isoallergeniche, determinate da sostituzioni aminoacidiche o da differenze nella quota di carboidrati presenti nella molecola.

Libraries di un DNA complementare Il principio della clonazione molecolare è basato sulla preparazione o l'isolamento del DNA che codifica il polipeptide rilevante per inserirlo in un plasmide o in un vettore batteriofagico, che può essere successivamente utilizzato per infettare un microrganismo come l'Escherichia coli. Il plasmide o il batteriofago si moltiplicano all'interno dell'Escherichia coli producendo colonie trasformate (nel caso del plasmide) o placche (nel caso del batteriofago). Preparare ed isolare un DNA che codifica il polipeptide o la proteina. Si inserisce in un plasmide o in un vettore batteriofago che infetta l’EC. Il plasmide o il batteriofago si moltiplicano promuovendo la sintesi dell'allergene nel microrganismo. In questo modo é’ come se l’escherichia coli producesse la beta lattoglobulina clonata Braren I, et al. Clin Chem 2007;53:837-44.

284 aminoacidi del Pen a 1 Una volta che conosciamo le 4 strutture della proteine siamo in grado di clonarlo, cioè copiarlo in serie. Quindi da un allergene naturale siamo in grado di ottenere vari allergeni ricombinanti. Per conoscere la struttura primaria occorre conoscere la catena di aminoacidi. Struttura primaria della proteina del gamberetto Abbiamo le impronte digitali di quella proteina Basi puriniche e pirimidiniche (citosina) Adenina, guanina, tiamina Reese G, et al. Clin Exp Allergy 2006;36:517-24.

Analisi spettroscopica The CD spectroscopic analysis (Fig sopra) showed that both natural and recombinant Pen a 1 had alfa-helical structures. Both curves were almost identical and showed the characteristic minima at approximately 208 and 222 nm. The shapes of the spectra were consistent with a-helically folded proteins. The secondary structure estimation that resulted from fitting predicted 67% (nPen a 1) and 66% (rPen a 1) a-helical and 2.2% (nPen a 1), 2.3% (rPen a 1) b-sheet, 30.8% (nPen a 1) and 31.7% (rPen a 1) random Reese G, et al. Clin Exp Allergy 2006;36:517-24.

Cos’ è un epitopo? L’epitopo, o determinante, é la componente strutturale dell’allergene responsabile dell’interazione specifica con l’anticorpo IgE. L’epitopo é la parte reattiva della proteina. Quindi si possono clonare anche solo epitopi, cioé piccole sequenze aminoacidiche.

Gli epitopi lineari e conformazionali Sampson HA. J Allergy Clin Immunol 2004;113:805-19.

Siero albumina bovina

Epitopi della siero albumina bovina 1. BSA amino acid sequence: the molecule is made up of three homologous domains brought into nine loops by 17 disulfide bonds. Gray units represent cysteine residues, all involved in S-S bonds apart from the 10th amino acid of the sequence (residue 34 of the precursor). The major sequential epitope is indicated by the sequence of barred units Restani P. Allergy 2004;59 Suppl 78:21-4

Come possiamo utilizzare queste informazioni nella diagnostica ? Diagnosi primaria di allergia alimentare Precoce predizione della persistenza dell’allergia alimentare Predizione di reazione severa al Tpo Determinazione delle cross-reattività Come si calano le applicazioni dell’allergologia molecolare nella diagnostica dell’allergia alimentare?

La tecnica dei microarray I pallini grigi sono le proteine ricombinanti Le Y blu sono le IgE specifiche Dopo incubazione e lavaggio: Le Y rosse sono gli anticorpi anti IgE dell’antisiero fluorescinato (stellina gialla): tecnica sandwich Lettura scannerizzata: il chip(cioé il vetrino) viene scannerizzato con un lettore laser confocale a fluorescenza I colori indicano le quantità di IgE e la lettura viene restituita sia sottoforma di foto che di tabella, la quale mostra l’intensità media di fluorescenza emessa da ogni singolo spot. Un software analizza i valori ottenuti in relazione alla curva di riferimento ed i risultati sono espressi sia in termini quantitativi (IU/ml) che qualitativi. Harwanegg C. et al. Clin Exp Allergy 2003;33:7-13.

Diagnosi di sensibilizzazione 88 proteine testate. La cute reagisce come il pozzetto. Relativo ad adulto. Non si potrebbe utilizzare nel bambino per la superficie corporea. Ci sarebbe spreco di allergene ricombinante. Ma c’é somiglianza. Hiller R, et al. FASEB J. 2002;16:414-6.

Allergia alla carota r Dau c 1.0104, r Dau c 1.0201 e r Dau c 4 erano clonati attraverso E. Coli. Erano valutati i sieri di 40 pazienti allergici alla carota con challenge positivo 98% dei pazienti allergici alla carota erano positivi ad almeno un ricombinante 98 % rDau c 1.0104 65% rDau c 1.0201 38% to rDau c 4 Dau c 1 e Dau c 4 sono PROFILINE Ballmer-Weber BK. Clin Exp Allergy 2005; 35:970–8

I test con l’allergene naturale purificato   I test con l’allergene naturale purificato Allergeni testati Performance del test The physician’s viewpoint The patient’s viewpoint The study Test outcome interpretation   Sen (%;CI) Spe (%;CI) PPV (%) NPV LR+ (P) LR- Pre-test odds (P) Post-test odds (P) P(T+) P(T-) CM SPT 97.91 (92.60-103.22) 76.00 (60.44-91.55) 79.66 97.43 4.07 0.02 0.96 3.91 0.79 sp IgE Ab 100 (100-100) 80 (65.42-94.57) 82.75 5 4.8 0.82 nBos d4 62.5 (44.49-80.50) 86 (73.35-98.64) 81.08 70.49 4.46 0.43 4.28 0.81 0.29 nBos d5 62.50 (33.50-70.65) (85.34-102.65) 81.81 nBos d8 58.33 (40-76.66) 88 (76.16-99.83) 89.28 67.14 8.68 0.50 8.33 0.89 0.32 Allergogramma più chiaro Legge dell’ azione di massa: riconoscimento completo 4 alfa lattoalbumina 5 beta lattoglobulina 8 caseina Fiocchi A. data on file  

Precoce predizione della persistenza dell’allergia alimentare Parleremo di uova e latte vaccino. Occorrerebbe troppo tempo per studiare la letteratura per i vari alimenti Lo studio delle IgE contro alcuni epitopi di latte e uovo può essere predittivo della storia naturale. I conformazionali sono distrutti dalla cottura o dall’idrolisi Gli epitopi sequenziali no Sampson HA. J Allergy Clin Immunol 2004;113:805-19.

Ovomucoide ed epitopi lineari Ovomucoide è una proteina glicosilata composta da 186 aminoacidi (Gal d 1.1, 1.2 e 1.3). I 3 domini dell’ovomucoide erano isolati e valutati con sieri di pazienti allergici all’uovo. Una protratta allergia all’uovo è associata alla presenza di significative quantità di IgE anti epitopi lineari (sequenziali) mentre le forme a rapida tolleranza erano associate ad IgE verso epitopi conformazionali. Osservazione datata 10 anni Cosa vuol dire 1.1 ? Cooke SK, et al. J Immunol 1997;159:2026-32.

Più lunga tolleranza all’uovo se IgE per lineari 2/3 degli allergici all’uovo sono tolleranti nei primi 5 anni di vita Si è valutato il legame delle IgE di bambini con allergia all’uovo, transitoria o persistente, rispetto agli epitopi conformazionali o sequenziali (lineari) di ovomucoide, ovoalbumina, ovotransferrina. I bambini con protratta allergia all’uovo presentano IgE elevate contro epitopi sequenziali dell’ovomucoide e dell’ovoalbumina (P < 0.01). La presenza sierica di IgE diretti contro epitopi lineari dell’ovomucoide dovrebbero essere usati come strumento per identificare i casi a più lenta risoluzione. Järvinen KM, et al. Allergy 2007;62:758-65.

IgE contro epitopi lineari dell’ovomucoide Järvinen KM, et al. Allergy 2007;62:758-65.

Le IgE leganti peptidi per il latte vaccino Osservare il comportamento delle IgE dirette contro alcuni epitopi orienta nel predire la durata della malattia Persistenti, tolleranza tardiva, tolleranza Dopo un lavoro svolto solo su 10 pazienti ecco la segnalazione di una casistica più ampia. Studio con 74 pazienti positivi al challenge con APLV 29 divennero tolleranti (15 di questi ad un età media di 3 anni) 14 tolleranti ad una media di 8 anni. 45 bambini ancora con APLV ad una media di 8 anni. 5 peptidi, con lunghezza di 10 aa, raoppresentavano gli epitopi su varie frazioni di caseina (alfa 1 e 2 e k) erano sintetizzati come ricombinanti Sono stati scelti perché precedentemente identificati come marcatori di CMA persistente Le IgE specifiche per i decapeptidi erano più alte in chi manteneva la malattia più a lungo Beyer K, et al. J Allergy Clin Immunol 2005;116:704-5.

Cosa accade per i singoli peptidi? Beyer K, et al. J Allergy Clin Immunol 2005;116:704-5.

Predizione di reazione severa al Tpo MAL D 1= difensina (termolabile) MAL D 2 = poco importante allergologicamente MAL D 3 = Lipid Transfer Protein (termostabile) MAL D 4 = bet v2= può dare SOA Non é solo una proteina della mela. E’ presente anche in altre rosacee come la pesca. Le PR-14, infine, sono anche dette lipid transfer protein (LTP) e la loro funzione biologica consiste nel trasferimento di fosfolipidi dai liposomi ai mitocondri, ma possiedono anche attività antimicrobica: per questo si trovano negli strati più esterni proprio per la loro capacità antimicrobica. Si trovano negli strati epiteliali esterni degli organi delle piante e questo spiegherebbe la maggiore allergenicità della buccia rispetto alla polpa di alcuni frutti. Resistenza alla digestione con pepsina, al trattamento con il calore e alle variazioni del pH. Non tutte le LTP sono allergeniche Numerosi studi hanno dimostrato che l’LTP è l’allergene chiamato in causa nei soggetti con OAS non associata a pollinosi nell’Area Mediterranea. Probabilmente ciò è spiegabile in quanto il paziente si può sensibilizzare direttamente attraverso la via gastrointestinale. Sono state identificate almeno 59 molecole allergeniche appartenenti a questa famiglia tanto da poterla considerare un panallergene pur non essendo tra loro tutte cross reattive allergici alla LTP riescono a tollerare la frutta contenente questa proteina, dopo averla sbucciata[i] van Ree riferisce che i livelli di LTP possono variare di 100 volte da coltivazione a coltivazione LTP Presente nella marmellate di frutta, crema di nocciole) e nelle bevande (succhi di frutta Dai dati della letteratura, provenienti essenzialmente dalla Spagna e dall’Italia, risulta che le persone che vivono nell’area mediterranea si sensibilizzano prevalentemente alla LTP della pesca altri che anzi, suppongono una possibile primitiva sensibilizzazione per via inalatoria in quanto alcune LTP sono presenti nei pollini di alcune piante

La peluria della pesca è ricca di LTP Allergia a LTP comune nell’area mediterranea ma assente nei Paesi nordici. Le pesche sono il principale agente sensibilizzante a LTP Gli allergici a LTP della pesca spesso tollerano altre Rosacee e sono cuti e RAST negativi alle loro LTP La peluria della pesca contiene elevate quantità di LTP che esiste anche nella buccia La peluria della pesca induce la sensibilizzazione a LTP La peluria viene eliminata durante il trattamento della pesca mediterranea prima di andare a mercati lontani La rimozione sistematica della peluria diminuisce l’allergenicità della pesca. Sensibilizzazione per via transdermica Un paziente può sensibilizzarsi unicamente alla LTP della pesca oppure a tutto lo spettro di LTP contenuto in una vasta schiera di frutta o vegetali. Anche in questo caso sono state formulate svariate ipotesi ed osservazioni: ·          Asero non è di questa opinione ma suppone che il riconoscimento dell’allergene sia affidato solo ad alcuni epitopi in esso presenti, riconosciuti solo dai pazienti con alti livelli di IgE specifiche per Pru p 3 Asero R, et al. Allerg Immunol (Paris). 2006;38:118-21.

Predizione della cross-reattività: le definizioni   Cross-sensibilizzazione: presenza di IgE che reagiscono con proteine di origine differente portatrici di epitopi simili od identici Cross-reattività: reazione clinica ad agenti diversi, alimentari e/o inalanti, dovuta a cross-sensibilizzazione.   Brusic V. et al. Allergy 2003;58:1083–1092

Frequenza di BA in CMA CMA BA 100% 13-20% Martelli A. et al. Ann Allergy Asthma Immunol 2002;89(6 Suppl 1):38-43.

La monosensibilizzazione é rara C’è la possibilità di caratterizzare la sensibilizzazione alle proteine dell’arachide. Nel 50% dei casi c’è sensibilizzazione a tutti e 3. L'allergia all'arachide (Arachis hypogea) è una delle principali cause di anafilassi fatale. h1 Vicilina priva di reattività con altre leguminose h2 glicoproteina omologie con la famiglia delle conglutine h3 allergene minore - glicinina Tre dei maggiori allergeni, Ara h 1, Ara h 2 e Ara h 3, sono largamente rappresentati nell'arachide. Ara h 1, una glicoproteina di 65,5 kDa, appartiene alla famiglia delle vicilina Ara h 2, una glicoproteina di 17,5 kDa, fa parte della famiglia della conglutinina. Ara h 3 e Ara h 4 sono allergeni rispettivamente di 14 kDa e 35,9 kDa appartengono alle famiglie delle glicinine. Ara h 6 di 14,5 kDa e Ara h 7 di 15,8 kDa hanno sequenze simili ai membri della famiglia della conglutinina Beyer K. Curr Opin Allergy Clin Immunol 2003;3:189-97.

Probabilità di reazione ad alimenti cross reattivi Sicherer SH. J Allergy Clin Immunol 2001;108:881-90

I limiti del test… Non è stata ancora segnalata la sensibilità e la specificità del test per singola molecola allergenica. Pochissimi lavori che esprimano la riproducibilità del test. A seconda della fase solida che lega l’allergene risultati possono essere differenti Difficile predizione della reazione clinica Pertanto impossibile per ora collocarlo nell’iter diagnostico

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Cosa speriamo di aspettarci Una specifica identificazione delle molecole allergeniche per il bambino allergico La riscrittura della storia naturale di alcune allergie alimentari in base alle molecole allergeniche coinvolte. Lo studio di sottogruppi, per le singole allergie alimentari, che potrebbero avere corrispondenza al test di provocazione orale La possibilità di utilizzare un vaccino sub-linguale specifico per desensibilizzare il bambino (esperienza in Spagna dell’LTP nello studio EXPO) Informazioni ulteriori per le cross-reattività Sapere se c’è corrispondenza fra tipo di patologia allergica espressa e la presenza di reattività a particolari molecole allergeniche. Studio EXPO

Sarà così lo scenario futuro? Harwanegg C. et al. Clin Exp Allergy 2003;33:7-13.

Conclusioni Il test permette di acquisire informazioni sempre più complete e dettagliate, ma anche di sempre più difficile interpretazione. Tali esami devono essere considerati come test di 3° livello, da effettuarsi per approfondire la diagnostica di particolari sottogruppi di bambini già sottoposti ai test classici. Molta strada va percorsa per conoscere vantaggi e limiti delle nuove tecnologie, definirne uso ed abuso, e arrivare infine a tracciare adeguate linee-guida per il loro impiego clinico.

Ecco una diapositiva per ricordare che Francesco De Angelis, nel tardo pomeriggio di oggi, ci parlerà di come si vive con l’allergia in mezzo al mare. Ovviamente bene. Ma non è questo che volevo dire. La diapositiva rappresenta l’incontro storico fra Amerigo Vespucci e Luna Rossa. Vedete come la tecnologia è progredita negli anni. Luna Rossa si può paragonare alle nuove e moderne tecniche diagnostiche derivate dall’allergologia molecolare. Ma se non ci fosse stato un equipaggio all’altezza, capace di capire le potenzialità e i limiti della barca, LR non avrebbe potuto raggiungere i risultati ottenuti. Allo stesso modo occorre che il Pediatra faccia tesoro di queste conoscenze ma sia sempre in grado di capirne i limiti e i vantaggi.