Corso di Perfezionamento NUOVI SVILUPPI NELLA DIAGNOSTICA MICROBIOLOGICA E VIROLOGICA (II edizione) 3° modulo: Micologia e Parassitologia 5-6 Novembre 2004 Pneumocistosi Prof. Guglielmo Gargani Dr. Gabriella Pini Dipartimento di Sanità Pubblica sez. Microbiologia Università degli Studi di Firenze

Pneumocystis carinii : La storia

Attuale posizione tassonomica Phylum Ascomycota Classe Archiascomycetes Ordine Pneumocystidales Famiglia Pneumocystudiaceae Genere Pneumocystis Specie Pn carinii (ratto) Pn jiroveci (uomo)

Ciclo vitale Trofozoita ameboide negli alveoli con filopodi Moltiplicazione per scissione binaria Cellule aploidi che evolvono in sporoblasti Sporoblasti o cisti producono all’interno 8 sporozoiti Sporozoiti si liberano e ricomincia il ciclo

Ciclo Vitale

Mayor Surface Glicoprotein (MSG) P.m. 95-160 kDa Nucleo centrale proteico Catene laterali carboidrati azotati glucosio mannosio n-acetil glicosamina Adesione agli pneumociti Determinanti Antigeni Special form

“Special form” carinii rattus muris equi harictologi mustelae suis homini o Pn.jiroveci ratto topo cavallo coniglio furetto maiale uomo

Classi di eterogeneità Fra special form da specie animali diverse Fra special form della stessa specie animale Fra ceppi della stessa specie animale

Pneumocystis organisms : I fact, what the Pneumocystis organisms are ? They are highly diversified microfungi found in the lung of mammals. Probably the most important advances in Pneumocystis research for the last years were, on the one hand, the revelation of a marked genetic heterogeneity of Pneumocystis organisms that led to the identification of several Pneumocystis species, and, on the other hand, the revelation of their fungal nature. [SLIDE] Since at the light microscopy level these parasites had a similar morphology in different mammals, it was considered for almost one century that Pneumocystis strains from different host species belonged to a unique species, Pneumocystis carinii described by Delanoë and Delanoë in 1912 [SLIDE] However, on the basis of marked genomic, karyotypic and phenotypic divergence this view has radically changed at present [SLIDE], and multiple species in the genus are being recognized in the different mammals. Pneumocystis jiroveci Frenkel, formerly named P. carinii forma specialis hominis, was the sole species identified in humans until now.

Pneumocistosi A partire dal 1920 compare in bambini istituzionalizzati in Europa occidentale. Dopo la II guerra mondiale è nei bambini denutriti in Europa orientale e M.O. Dopo gli anni ‘50 in immunodepressi Dopo il 1985 è causa frequente di morte in HIV positivi

Human Pneumocystis Infection Dei-Cas E, 2000, Med Mycol 38 In short, taken together, these observations indicate that Pneumocystis jirovecii organisms circulate actively in human or other mammal populations in which they may meet hosts with various levels of susceptibility it may therefore be hypothesized that airborne Pneumocystis infection can display a large spectrum of clinical presentations of which we know only very few thus, the real clinical and epidemiological impact of Pneumocystis infections in humans is underestimated, and probably we recognize at present just the tip of the iceberg Dei-Cas E, 2000, Med Mycol 38

Forme clinico-epidemiologiche Infezione asintomatica o non diagnosticata Forma epidemica :dispnea progressiva, cianosi, perdita di peso diarrea. Febbre e tosse possono mancare Forma sporadica in immunodepressi: prevalentemente polmonare altre localizzazioni possibili

Potential implication of Pneumocystis in SIDS Pneumocystis cysts were detected in lungs from : 31% of 134 cases of Sudden Infant Death Syndrome (SIDS) in Chile 15% of 27 SIDS patients in Oxford (UK) 3% of 342 infants deceased from other causes Vargas et al, Clin Infect Dis 1999 Regarding the potential involvement of Pneumocystis in the occurrence of Sudden Infant Death Syndrome, Vargas and coworkers have reported the presence of Pneumocystis cystic clusters in 31% of SIDS cases from Chile, and in 15% of 27 SIDS patients from Oxford. In contrast, Pneumocystis was detected in less than 3% of infants deceased from other causes. We have examined paraffin embedded lung samples of the children studied by Vargas and his coworkers. Nested PCR methods, associated with direct sequencing allowed us to identify two genotypes of Pneumocystis jirovecii. These two variants of P. jirovecii were found to be responsible for PcP in other contexts.

Polmonite da P. jiroveci Sintomatologia Dispnea, tosse non produttiva Cianosi, febbre Reperti radiologici infiltrati polmonari Evololuzione più rapida in HIV positivi

Immagini radiologiche Infiltrati interstizio-alveoloari prevalentemte nei lobi inferiori Possibile reperto negativo fino a poche ore prima dell’exitus

Polmonite da P. jiroveci

Polmonite da P. jiroveci Polmonite interstiziale plasmacellulare Ispessimento spazi interalveolari Alveoli ripieni di sostanza amorfa con ammassi di parassiti

Polmone in pneumocistosi Le frecce indicano zone confluenti grigio pallido

Cisti negli spazi alveolari

Pneumocistosi

Pneumocystis carinii

Corpi intracistici

P. jiroveci: cisti al microscopio elettronico a trasmissione P.jiroveci: cisti al microscopio elettronico a trasmissione. Sono visibili corpi intracistici e una spessa parete

Altri fattori di rischio Tutte le emopatie Tumori solidi Adenocarcinoma mammario Tumori cerebrali Immunosoppressione per trapianti

Tipologia di campioni clinici Pneumocistosi Diagnostica di Laboratorio Tipologia di campioni clinici Sensibilità tecniche di colorazione >95% >90% 50-95% 50-85% Bassa Materiale Biopsia aperta del polmone Biopsia transbronchiale Lavaggio broncoalveolare (BAL) Sputo indotto (IS) Risciacquo orale (OW) Brushing orale

Bronchoalveolar lavage Induced sputum Bronchoalveolar lavage More expensive, more invasive, risk of periprocedural sedation, requires skilled personnel Larger samples can be sent for staining and can be used to diagnose other infections (bacterial, fungal, viral and mycobacterial cultures) Saline instilled through bronchoscope wedged in airway and fluid withdrawn To 95 percent sensitive Nebulized saline inhaled by patient to promote deep cough Inexpensive; noninvasive Specimen processing more complex, may delay diagnosis of another pathogen Less sensitive

Esame diretto Colorazione metenamina-nitrato di argento Gomori- Groccot Colora l’involucro della cisti in nero su fondo verde Blu di toluidina Colora selettivamente l’involucro della cisti Colorazione di Giemsa o sua variante rapida Colora sia cisti che trofozoiti  nucleo porpora, citoplasma blu (non colora la parete cistica)

                                                     P.carinii: Con alto ingrandimento sono visibili le cisti di 5-8μm di diametro. L’involucro delle cisti è colorato in nero, i corpi intracistici non sono visibili. Biopsia aperta del polmone. Impregnazione argentica secondo Gomori (GMS)

P.carinii: sedimento di BAL colorato con metenamina-argento (GMS) che colora l’involucro cistico. Sono visibili cisti rotonde, ovali o piatte di circa 4-5 µm di diametro Tutti i fungi hanno la stessa affinità per metenamina-argento e possono essere confusi con le cisti di P.carinii. Cryptococcus neoformans in un campione di BAL (GMS).

Colorazione con blu di toluidina

Trofozoiti di P. jiroveci in BAL. Giemsa Trofozoiti di P. jiroveci in BAL. Giemsa. I trofozoiti sono piccoli (1-5 µm) e solo i loro nuclei, colorati in porpora , sono visibili (frecce).

P. carinii: Sono visibili cisti (approx P.carinii: Sono visibili cisti (approx. 5-8 µm di diametro) con corpi intracistici, le cisti mature ne contengono 8. Alcune cisti appaiono vuote. Colorazione di Giemsa.

Giemsa

Campione di BAL, colorazione Fungi-Fluor Kit Polysciences Europe, Germany (400X) Fungi-Fluor non colora specificamente P. carinii (Colora chitina e cellulosa). Le cisti appaiono in clusters circondati da essudato schiumoso, il background di fondo interferisce con la chiarezza dell’immagine

                                                     cisti che mostrano le strutture caratteristiche a doppia parentesi o virgola

Esame diretto Immunoflurescenza con anticorpi monoclonali (contro ag di superficie, forma cistica e trofozoite) aumento sensibilità Kit commerciali MonoFluo kit pneumocystis Bio-Rad laboratories MeriFluor pneumocystis kit Meridian Bioscience Europe Light diagnostics Pneumocystis carinii DFA Chemicon USA

MeriFluor Pneumocystis kit Meridian Bioscience Europe Immunoflurescenza diretta con anticorpi monoclonali MeriFluor Pneumocystis kit Meridian Bioscience Europe

Immunoflurescenza diretta con anticorpi monoclonali                                                          Immunoflurescenza diretta con anticorpi monoclonali Light diagnostics Pneumocystis carinii DFA, Chemicon USA

Immunofluorescenza indiretta con ac monoclonali MonoFluo kit pneumocystis Bio-Rad laboratories

MONOCLONAL ANTIBODY STAINS TRADITIONAL STAINS MONOCLONAL ANTIBODY STAINS are less expensive require less technical expertise and quipment may allow the identification of other pathogens on the specimen clearly differentiate the P. carinii organism may be more sensitive, particularly in specimens with low numbers of organisms false positives are a problem associated with using the monoclonal antibody stains.

Esame colturale Ricerca di anticorpi Ricerca di antigeni Pneumocystis non si sviluppa in sistemi di coltura continua in vitro Esame colturale Non utilizzabile per la diagnosi di pneumocistosi Ricerca di anticorpi ELISA con ac policlonali su Siero Sensibilità 210ng ag (McNabb, 1988) Immunoblotting con ac monoclonali (2G2) su BAL Aumento della sensibilità (Sethi, 1990) Metodi non utilizzati a scopo diagnostico Ricerca di antigeni

Metodi biomolecolari Gene targets Single copy genes Scopo: aumentare la resa diagnostica dei campioni clinici meno invasivi (sputo indotto, lavaggio orale….) Gene targets Single copy genes Ø      Dihydropteroate synthase (DHPS) Ø      Tymidylate synthase (TS) Ø      Internal trscribed spacer (ITS) Ø      5S rRNA Ø      18S rRNA Multicopy genes Ø  Mitochondrial large subunit rRNA (mt LSU rRNA) Ø  Mitochondrial small subunit rRNA (mt sSU rRNA) Ø  Major surface glycoprotein (MSG)

Lane S: Standard dei pesi molecolari Lane 1: PCR a singolo step con primer pAZ102-E/pAZ102-H, banda di amplificato di 346bp (Wakefield, 1990) Lane 2: nested PCR con ITS primer 1724F/ITS2R per il primo step ITS1F/ITS2R1 per il secondo step, banda di amplificato di 550bp. (Lu, 1995) Wakefield AE, Pixley FJ, Banerji S, Sinclair K, Miller RF, Moxon ER, Hopkin JM. Amplification of mitochondrial ribosomal RNA sequences from Pneumocystis carinii of rat and human origin. Mol Biochem Parasitol 1990;43:69-76. Lu JJ, Chen CH, Bartlett MS, Smith JW, Lee CH. Comparison of six different PCR methods for detection of Pneumocystis carinii. J Clin Microbiol 1995;33:2785-2788.  

Metodi biomolecolari Significatività della ricerca del DNA nel BAL mediante PCR PCP clinicamente evidente Assenza di segni clinici evidenti HIV- HIV+ Non predittivo (17% positivi con nested PCR senza sviluppo della malattia, Sing 2000) Semplice colonizzazione o fase precoce di malattia? Consigliato un attento monitoraggio Valore altamente predittivo

Metodi biomolecolari Sensibilità delle metodiche di ricerca del DNA con PCR su altri campioni clinici IS  Maggiore rispetto ai metodi di microscopia classica (Wakefield 1990, >95% con mt LS rRNA primers) OW  Maggiore rispetto ai metodi di microscopia classica (Wakefield 1990, 56-78%. Fischer 2001, 91% con MSG primers) Bassa se la colonizzazione polmonare è scarsa (Matos, 2001) Siero  Risultati contraddittori con sensibilità da 0 a 100%

Kit Commerciale per PCR PNEUMO KIT (AB Analitica) Kit completo per Estrazione del DNA da BAL, altri campioni respiratori o tessuti fissati e inclusi in paraffina Amplificazione (Gene target: rRNA 5S) Elettroforesi su gel di agarosio: amplificato di 120pb Controllo interno di amplificabilità (β-globina) Controllo positivo

M-PCR Kit Maxim Biotech San Francisco USA Lane M: Standard dei pesi molecolari Lane 1: Controllo negativo Lane 2: controllo positivo Lane 3: Clamydia pneumoniae Lane 4: Mycoplasma pneumoniae Lane 5: Pneumocystis carinii Lane 6: Legionella pneumophyla Multiplex-PCR

Quantitative Touch-Down Real Time PCR MSG primers Sonde FRET Campioni OW cut-off a 50 copie DNA per tubo distingue fra infezione e colonizzazione (Larsen 2004) Campioni BAL cut-off a 103 copie DNA per tubo distingue portatori da pazienti con PCP (Flori 2004)

Metodi biomolecolari Vantaggi Svantaggi Aumento della sensibilità Elevata specificità Utile per i pazienti che non possono sopportare procedure invasive Svantaggi Stadio sperimentale Mancanza di metodi standard riconosciuti a livello internazionale Possibili risultati positivi di difficile interpretazione

Metodi di biologia molecolare scopi epidemiologici Ritrovamento di DNA di P.carinii nelle stanze di pazienti infetti e nell’ambiente esterno ciclo vitale al di fuori dell’ospite? Studi di tipizzazione genomica Esiste un genotipo prevalente Diversa virulenza dei genotipi? E’ possibile la coinfezione con diversi genotipi Recidiva entro tre mesi Stesso genotipo Recidiva dopo più di sei mesi Genotipo diverso

Epidemiologia delle infezioni da P. jiroveci Distribuzione territorialmente differenziata degli stipiti Stipiti isolati dai pazienti: Non corrispondono al genotipo prevalente nella regione di nascita Corrispondono al genotipo prevalente nella regione dove si è manifestata la malattia

Vargas et al, 2000, JCM 38 - 8; Miller et al, 2001, JCM 39 Evaluating Pneumocystis airborne transmissibility between hosts with PcP, carriers and susceptible hosts ? ? Pneumocystis DNA was detected in healthcare contacts of PcP patients Vargas et al, 2000, JCM 38 - 8; Miller et al, 2001, JCM 39