Lucia Martelli Diagnostica microbiologica delle infezioni delle basse vie respiratorie Lucia Martelli

LA DIAGNOSI MICROBIOLOGICA influenza la terapia che è in funzione di permette di individuare cluster epidemici permette di individuare patologie causate da patogeni non endemici in quell'area Infezioni basse vie respiratorie Presenza di patogeni piu frequentemente isolati oppure di patogeni non comuni Presenza di patogeni che mostrano antibiotico resistenza Presenza di patogeni per i quali le linee guida non prevedono un trattamento ottimale

Perchè una corretta diagnosi eziologica è importante? per studiare landamento dellantibiotico resistenza Per aumentare laccuratezza delle raccomandazioni delle linee guida Per guidare i comportamenti in caso di patologie particolari come SARS, Influenza,Legionellosi patologie da bioterrorismo Infezioni basse vie respiratorie

La diagnosi microbiologica rende possibile una: Diagnosi probabile Diagnosi definita Infezioni basse vie respiratorie quadro clinico compatibile + rilevazione di un patogeno polmonare in quantità medio alta (in modo semiquantitativo) quadro clinico tipico + agente eziologico probabile un campione non contaminato + probabile patogeno che non colonizza le vie respiratorie superiori

nelle cap che necessitano di ricovero per pazienti ospedalizzati per pazienti immunocompromessi con infezioni delle basse vie Infezioni basse vie respiratorie La diagnosi microbiologica gravità della malattia nelle bronchiti nelle cap non complicate e in assenza di fattori di rischio (sono sufficienti le linee guida) Eimportante ma non sempre efficace È limitato

Fattori interferenti con la diagnosi microbiologica - Adeguatezza del campione( assenza di contaminazione da parte della flora del tratto respiratorio superiore ) - Uso di test diagnostici i mportanti sono: rapidi e sensibili esame microscopico la ricerca di antigeni tests di biologia molecolare Infezioni basse vie respiratorie

Correlazione tra agenti patogeni ed età età microrganismi più probabili Neonati(0-1 mo) Escherichia coli, Streptococcus agalactiae lattanti (1-6 mo) Chlamydia trachomatis, RSV bambini (6 mo-5 yr) RSV, Parainfluenza Viruses ragazzi (5-15 yr) Mycoplasma pneumoniae, Influenza Virus Tipo A giovani adulti(16-30) Mycoplasma pneumoniae, Streptococcus pneumoniae adulti Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae Infezioni basse vie respiratorie

T ipo di polmonite patogeni comuni patogeni rari Acquisita in comunità S. pneumoniae, H. influenzae, Staphylococcus K. pneumoniae M.catarrhalis N. meningitidis Primaria atipica Mycoplasma pneumoniae Adenovirus, tosse non produttiva RSV, Clamydia spp. Influenza, Legionella spp., tuberculosis, polmoniti fungine acute Polmonite nosocomiale bacilli Gram neg(Enterobacter, legionella Klebsiella, Acinetobacter S. pneumoniae, Pseudomonas), S. aureus, batteri anaerobi Infezioni basse vie respiratorie Correlazione tra agenti patogeni e patologia

Tipo di polmonite patogeni comuni patogeni rari polmonite ematogena Staphylococcus spp., bacilli Gram negativi Streptococcus spp. polmonite in paz. batteri come nella CAP* Legionella,Listeria immunodepressi Pneumocystis carinii, Histoplasma, Cytomegalovirus, Coccidioides HSV, Nocardia sp. Funghi opportunisti * Candida * Mucor * Aspergillus Polmonite anaerobi da aspirazione Staphylococcus, Bacilli Gram negativi aerobi Infezioni basse vie respiratorie

Materiale Idoneo Diagnosi Microbiologica Germi comuni, Legionella Micobatteri Nocardia, miceti + P.carinii Escreato Escreato indotto Bronco Aspirato Lavaggio Broncoalveolare Lavaggio Bronchiale Idem Solo per Micobatteri, Legionella, P.carinii e miceti filamentosi Idoneo per tutte le ricerche batteriologiche,virologiche fungine parassitologiche Germi comuni,Miceti,Anaerobi Micobatteri,Legionella,Nacardia Liquido pleurico

Materiale Idoneo Diagnosi Microbiologica Sangue Urina Siero Batteri Gram+,Gram- Miceti Rilevazione antigeni di Legionella, Pneumococco Per ricerche di anticorpi ricerca di antigene di Aspergillus

La diagnosi Microbiologica Metodi diretti es batteroscopico su materiali es colturale respiratori emocoltura rilevazione di antigeni Metodi di amplificazione genica tecnologie microarray Metodi indiretti tests sierologici Infezioni basse vie respiratorie

Esame microscopico Permette di Infezioni basse vie respiratorie Stabilire l'idoneità del materiale Valutare la quantità di PMN e microrganismi (processo infiammatorio e infezione batterica) Fare una diagnosi presuntiva mediante il rilevamento di potenziali patogeni può indurre ad attuare iter diagnostici diversi da quelli routinari Metodi diretti

Inoltre Infezioni basse vie respiratorie di avviare una terapia empirica verso patogeni meno comuni e di abbandonare terapie inappropriate Di validare i risultati dell'esame colturale Di valutare l'azione inibente della terapia antibiotica su microrganismi presenti che non si sviluppano in coltura

Esame colturale Esame microscopico Materiale Biologico Idoneo Esame Colturale Isolamento batteri e miceti non esigenti Infezioni basse vie respiratorie

Esame colturale dei materiali ottenuti con procedimenti non invasivi spesso non è specifico nè sensibile Infezioni basse vie respiratorie l'eventuale precedente terapia antibiotica l'eventuale scarsa idoneità del campione difficoltà di interpretazione la presenza di flora delle alte vie che può includere eventuali patogeni (falsi positivi) o coprire il vero patogeno (falsi negativi) PerPer

Esame colturale di materiali ottenuti con procedimenti invasivi permette di attribuire un significato eziologico ai vari isolati se accompagnati da una valutazione numerica Infezioni basse vie respiratorie Metodi diretti

Esame colturale Infezioni basse vie respiratorie Incubazione a 37° per 24-48h In atmosfera normale o in Co2 Semina su terreni idonei LETTURA IDENTIFICAZIONE ANTIBIOGRAMMA (se previsto) Metodi diretti

Emocoltura Infezioni basse vie respiratorie E' raccomandata per tutti i pazienti con grave polmonite e se positiva permette di fare diagnos i Il più comune isolato è S.pneumoniae Si ha positività nel 5-14% Metodi diretti

Rilevazione antigeni su materiali respiratori si basano su Infezioni basse vie respiratorie Metodi diretti Agglutinazione al lattice Immunofluorescenza diretta EIA

Ricerca antigeni su materiali respiratori Vantaggi Sono rapidi Idonei per Virus influenzali A e B RSV Adenovirus Virus parainfluenza 1,2,3 HCMV HSV1,HSV2 Legionella, Pneumococco Metodi diretti Infezioni basse vie respiratorie

Rivelazione antigeni su urine Tests immunocromatografici S. pneumoniae e legionella pneumophila sier 1 Vantaggi Rapidi semplici Positivi anche dopo l'inizio della terapia Metodi diretti Infezioni basse vie respiratorie

S.pneumoniae Antigene (polisaccaride parete) Vantaggi Specificità >90% < nei bambini portatori sani Sensibilità 50-80% Infezioni basse vie respiratorie Svantaggi Cross-reattività con S.oralis e S.mitis Non distingue infezione in atto da infezione pregressa Il valore diagnostico è maggiore se associato a emocultura

Antigene urinario di legionella Il test non rileva tutti i sierotipi Vantaggi Sensibilità % Specificità 100% Svantaggi Positività prolungata nel tempo Infezioni basse vie respiratorie

Diagnostica molecolare Si basa Ricerca del DNA mediante amplificazione con metodica PCRRicerca del DNA mediante amplificazione con metodica PCR Tecnologia microarrayTecnologia microarray Infezioni basse vie respiratorie

Diagnostica molecolare identifica un organismo in base a sequenze geniche specifiche ESTRAZIONE ACIDO NUCLEICO AMPLIFICAZIONE CON PRIMER IDONEI A LIMITARE LA SEQUENZA GENICO SPECIFICA IDENTIFICAZIONE DNA AMPLIFICATO IMMUNO CROMATOGRAFIA CROMATOGRAFIA SU GEL DI AGAROSIO FLUORESCENZA (REALTIME) Infezioni basse vie respiratorie

Diagnostica molecolare Vantaggi Elevata sensibilità Elevata specificità Non necessita di isolamento batterico Non necessit di microrganismi vitali Può essere eseguita su materiale preventivamente congelato Determinazione qualitativa in Pcr tipo nested Determinazione quantitativa (virus erpetici latenti)

Diagnostica Molecolare Svantaggi Costo elevato Se qualitativa non indica se infezione in atto o pregressa Non consente di procedere alla determinazione della sensibilità ai chemioterapici Richiede esperienza di metodiche molecolari

Diagnostica Molecolare Nel nostro laboratorio vengono rilevati con PCR Virus respiratori Adenovirus VRS Influenza A-B HSV1-2 HCMV Batteri atipici Mycoplasma Legionella Chlamydia MicetiAspergillo

Microarray Rappresenta un potenziale interessante per il laboratorio di microbiologia Un DNA microarray (o DNA chip) è costituito da una collezione di microscopiche sonde di DNA attaccate ad una superficie solida. Permette di Esaminare il profilo di espressione di un gene Di identificare un gene in una miscela di migliaia Sfrutta la tecnica di ibridazione inversa

Microarray Vantaggi Rapido (non necessita di reazioni di amplificazione) E' un sistema miniaturizzato Dotato di alta processività Permette analisi parallele su larga scala Nei laboratori di ricerca è stato utilizzato per 1.Identificare funghi patogeni coinvolti nelle micosi invasive 2.Identificazioni batteriche 3.Per una rapida identificazione da bottiglie di emocolture positive

Metodi sierologici Tests di immunofluorescenza Tests di FC Non sono utili per una diagnosi precoce Sono importanti a scopi epidemilogici Utili per la diagnosi di infezione dei patogeni atipici Necessitano di due campioni uno in fase acuta ed uno in fase di convalescenza (sieroconversione) Permette di valutare se infezione in atto o infezione pregressa Infezioni basse vie respiratorie Metodi indiretti

Diagnostica di alcune patologie

Polmonite da C.pneumoniae La C.pneumoniae è responsabile del5%- 15% delle polmoniti Raramente è necessario il ricovero (anziani con comorbidità, associata ad altri patogeni) La reinfezione è comune

Polmonite da C.pneumoniae Diagnosi microbiologica difficile La chlamydia è difficilmente coltivabile La sierologia è problematica e non specifica Nelle infezioni primarie le IgM possono impiegare anche 3 settimane a manifestarsi Le IgG 8 settimane: la negatività non esclude la malattia Nelle reinfezione leIgM rimangono costanti Le IgG salgono rapidamente PCR con marchio CE e IVD Recentemente è uscita Real time PCR solo qualitativa Viene eseguita su materiale respiratorio É specifica per la specie

Polmonite da M.pneumoniae Il Mycoplasma è responsabile del10%-20% delle polmoniti nei giovani adulti Diagnosi Esame colturale (troppo lento) Tests sierologici Le agglut a freddo >1.64 supportano la diagnosi ma sono poco specifiche La reazione di FC rileva le IgM se il prelievo è precoce PCR con marchio CE e IVD

Legionellosi Diagnosi di laboratorio metodiche utilizzate: - esame colturale * - rilevazione dellantigene urinario - test di immunofluorescenza diretta * - rilevazione di anticorpi -ibridizzazione degli acidi nucleici * *E IMPOTANTE LIDONEITA DEL MATERIALE

Esame colturale Rappresenta il gold standard per la diagnosi ( per un risultato positivo occorrono da 3 a 5 giorni ) Materiali idonei sputo * campioni broncoscopici.Terreni idonei BCYE ( buffered charcoal yeast extract) BCYE con antibiotico

Esame colturale Fattori che influnzano la sensibilità Scarsa sopravvivenza nelle secrezioni Produzione scarsa di secrezioni

Esame colturale E importante per Confermare i risultati positivi dellantigenemia Individuare infezioni sostenute da specie e sierogruppi diversi da sier 1

Identificazione Vengono valutate le seguenti caratteristiche Capacità di crescita su BCYE Morfologia tipica delle colonie Capacità di reagire con antisieri specifici fluorescenti e non Test di ibridizzazione del DNA

Ricerca dellantigene urinario un metodo rapido che produce una diagnosi precoce (1 giorno dopo linsorgenza dei sintomi, può permanere per mesi ) Latg è un componente della frazione polisaccaridicadella parete Latg è un componente della frazione polisaccaridicadella parete RIA RIA Metodiche EIA ( per più sierogruppi ) Immunocromatografiche ( solo per legionella p. sier 1 ) E un esame ritenuto sufficiente a fornire un criterio microbiologico di certezza nelle definizione di caso

Antigene urinario Data la sua possibile permanenza protratta nelle urine può risultare difficile la distinzione tra infezione acuta fase di convalescenza infezione pregressa

Antigene urinario Test immunocromatografico ( BIOTEST ) Sensibilità % ( dopo centrifugazione aumenta ) Specificità 100 % Vantaggi semplicità rapidità Svantaggi rileva solo la presenza di Lp 1

Immunofluorescenza diretta Questa tecnica che utilizza anticorpi fluorescenti specifici messi a contatto con frammenti di tessuto polmonare o secrezioni respiratorie pemette di di rilevare le presenza di legionelle nei materiali respiratori di identificare eventuali colonie sviluppatesi su terreni selettivi per legionella

Immunofluorescenza diretta L. non pneumophila (specificità e sensibilità di questi reagenti non è stata ancora ben valutata) Permette di evidenziare le legionelle anche dopo alcuni giorni dallinizio della terapia antibiotica E possibile identificare L.pneumophila (sensibilità da 25 a 75% specificità sup a 95%)

Diagnosi sierologica La rilevazione di anticorpi specifici (IgG, IgM IgA ) può essere fatta con varie metodiche Immunofluorescenza indiretta Metodi immunoenzimatici Metodi di microagglutinazione E utile per una diagnosi retrospettiva ( E significativo un aumento del titolo di almeno 4 volte)

PCR Produce : Diagnosi rapida Rileva la presenza di varie specie e sierogruppi di legionella E applicabile a campioni ambientali Ha una sensibilità simile allesame colturale

Sindrome polmonare da hantavirus Malattia sistemica frequentemente letale Diagnosi Sierologica Rilevazione IgM specifiche IgG specifiche in aumento PCR Rilevazione RNA specifico nei capioni cinici

Polmonite da P.carinii In pazienti con deficit dell'immunità cellulo-mediata diagnosi immunofluorescenza diretta sul BAL PCR

Aspergillosi polmonare Diagnosi es. microscopico diretto non specifico Rilevazione del galattomannano su siero -La positività può precedere di 5-8 gg i sintomi clinici -Il test dovrebbe essere usato come screening -La rilevazione di risultati positivi in due campioni successivi supporta la diagnosi -Può essere usato come follow up della risposta clinica alla terapia -Il titolo diminuisce in caso di risposta clinica eccetto che per i paz. In terapia con echinocandine Sensibilita 80% Specificità 89,2% PGR