Valutazione di laboratorio della coagulazione

Che cosa è il processo emostatico? Risposta dell’organismo ad una offesa  interruzione di continuità dell’endotelio. Uno dei più efficaci meccanismi di auto-regolazione che il nostro organismo possiede Evita perdite di sangue pur mantenendo nello stesso tempo la necessaria fluidità del sangue nel compartimento intravascolare  l’estensione del coagulo viene limitata alla sede della lesione Porta alla lisi successiva del coagulo

Bilancia emostatica Ipercoagulabilità Normale Ipocoagulabilità Emorragie Trombosi

Processo emostatico: descrizione Inizia quando il sangue viene a contatto con sostanze diverse da quelle presenti sulla superficie endoteliale delle pareti dei vasi. Emostasi primaria rapida formazione di un tappo piastrinico a livello della lesione avviene in pochi secondi fondamentale per arrestare la fuoriuscita di sangue dai vasi capillari e dalle venule Emostasi secondaria attivazione del sistema della coagulazione  formazione della fibrina  rafforza il trombo emostatico primario richiede alcuni minuti importante soprattutto per bloccare la fuoriuscita del sangue dai vasi di calibro maggiore

Fattori coinvolti nell’emostasi Vasi Proteine della coagulazione Piastrine Fibrinolisi / inibitori

Fattori coinvolti nell’emostasi Vasi  vasocostrizione dei vasi danneggiati cellule endoteliali e subendotelio Piastrine  formazione del tappo piastrinico complemento fattori della coagulazione  formazione del tappo di fibrina fattori della fibrinolisi  risoluzione del coagulo inibitori sistema macrofagico-monocitario PMN

emostasi primaria emostasi secondaria

1: fase vascolare - Lesione vasale  vasocostrizione reattiva (riduzione il flusso ematico) fenomeno transitorio riflesso nervoso; secrezione da parte delle cellule endoteliali di fattori  endotelina; favorisce il contatto del sangue con la matrice sottoendoteliale esposta dalla perdita di cellule endoteliali la matrice contiene proteine (in particolare collagene, proteoglicani e fibronectina) capaci di fare aderire le piastrine ed attivare la cascata della coagulazione La fase vascolare non viene valutata in laboratorio -

I FASE Una interruzione della continuità della parete vasale espone gli elementi del sottoendotelio

Eventi secondari al danno vascolare danno vascolare con esposizione del subendotelio (TF, vWF) adesione piastrinica mediata dal HMWvWF aggregazione piastrinica mediata dal fibrinogeno attivazione dei fattori della coagulazione (TF+ VIIa) formazione del trombo stabilizzazione del trombo mediata dalle piastrine e dalla fibrina risoluzione del trombo

2: fase piastrinica Contatto del sangue con sostanze non endoteliali  attivazione piastrinica adesione delle piastrine alla matrice extracellulare esposta (collagene) mediante recettori specifici e passaggio da una forma discoidale (discociti) ad una forma sferica (sferociti) con protrusione di pseudopodi (“shape change”) secrezione con liberazione di molecole ad attività vasocostritrice e/o pro-aggregante (serotonina, tromboxano TXA2, adenosindifosfato ADP e ioni calcio) aggregazione: mediata principalmente dall’ADP e dal TXA2 porta alla formazione di un aggregato piastrinico di crescenti dimensioni (tappo emostatico piastrinico o primario) in seguito alla produzione della trombina e della fibrina il tappo emostatico primario si trasformerà in una massa di piastrine saldate irreversibilmente  tappo emostatico secondario o definitivo

L’attivazione delle piastrine modifica profondamente la loro struttura e funzione

Le piastrine valori nel sangue: 150 - 450 x 10 /L. circa 2/3 circolano, mentre 1/3 risiede nella milza o sedi extravascolari;

Megacariocita ciascun megacariocita durante la sua vita genera circa 4,000 piastrine le piastrine vivono mediamente da 9-12 giorni ogni giorno sono prodotte 30.000-40.000 piastrine per mmc; in caso di necessita’, la produzione di piastrine puo’ aumentare 8 volte;

granuli piastrinici: alfa granuli vWF Fibrinogeno PF4 Beta tromboglobulina PDGF VEGF fattore V fattore XIII delta granuli (granuli densi) ADP serotonina Ca++

recettori granuli fattori coagulazione Fibrinogeno vWF alfa-granuli granuli densi actina

Ruolo delle piastrine nell’emostasi Step 1: Adesione Step 2: Rilascio contenuto dei granuli (ADP, trombina, catecolamine) Step 3: Aggregazione Step 4: Formazione del coagulo (fibrina) Step 5: Retrazione del coagulo

3. fase plasmatica o dell’emocoagulazione Danno vascolare  sintesi di fattori da parte delle cellule endoteliali + fattori prodotti dalle piastrine  cascata coagulativa; Consiste in una serie di conversioni di proenzimi inattivi in enzimi attivi Culmina con la trasformazione di una proteina plasmatica solubile, il fibrinogeno, in un polimero insolubile, la fibrina Ogni reazione segue questo schema: enzima (il fattore attivato)  agisce su un substrato (il fattore successivo nella forma non attiva) in presenza di un cofattore che accelera la reazione; Queste tre componenti fondamentali sono assemblate sul complesso fosfolipidico (FP3) espresso sulla superficie delle piastrine e tenute assieme dagli ioni calcio

La cascata coagulativa è costituita da un serie di reazioni enzimatiche. Per essere efficiente è necessario che enzima e substrato vengano a contatto ad una concentrazione ottimale.

TF VIIa

Mentre le piastrine aggregate formano il “tappo” piastrinico, il complesso TF/fattore VIIa attiva il fattore IX e X

Fattori plasmatici della coagulazione: Factor MW Plasma Concentration Required for Hemostasis (µg/ml) (% of normal concentration) Fibrinogen 330,000 3000 30 Prothrombin 72,000 100 40 Factor V 300,000 10 10-15 Factor VII 50,000 0.5 5-10 Factor VIII 300,000 0.1 10-40 Factor IX 56,000 5 10-40 Factor X 56,000 10 10-15 Factor XI 160,000 5 20-30 Factor XIII 320,000 30 1-5 Factor XII 76,000 30 0 Prekallikrein 82,000 40 0 HMWK 108,000 100 0

fattori vitamina K - dipendenti I fattori II, VII, IX e X sono definiti vitamina K - dipendenti in quanto necessitano della vitamina K per svolgere la loro azione biologica; la vitamina K è infatti indispensabile per l’azione di un enzima epatico (carbossilasi) che rende i fattori suddetti capaci di legare il calcio e di ancorarsi ai fosfolipidi piastrinici carichi negativamente In assenza di vitamina K, i fattori II, VII, IX e X vengono ugualmente sintetizzati dal fegato, ma risultano funzionalmente inattivi

La Trombina legata al suo recettore ora converte il fibrinogeno in fibrina, che viene polimerizzata e stabilizzata dal fattore XIIIa

Anticoagulanti e fibrinolisi TFPI

Il processo di coagulazione tende naturalmente ad autoamplificarsi Il processo di coagulazione tende naturalmente ad autoamplificarsi. Per tale motivo esso è modulato da numerosi meccanismi: La diluizione delle molecole procoagulanti La rimozione dei fattori attivati attraverso il sistema reticoloendoteliale, soprattutto del fegato La continua produzione di inibitori della coagulazione (anticoagulanti)

GLI ANTICOAGULANTI: sistema della TM-PC-PS La Trombina legata alla Trombomodulina (TM) attiva la Proteina C (APC) che ora è in grado di attaccarsi,con la proteina S (PS),sull’endotelio o sulle piastrine

GLI ANTICOAGULANTI: sistema AT-III eparina-eparano L’antitrombina III (AT-III) interagisce con l’eparano endoteliale o con l’eparina plasmatica e diventa un potente inibitore di proteasi

GLI ANTICOAGULANTI: il TFPI Il Tissue Factor Pathway Inhibitor modula l’attività sia del fattore Xa che del complesso TF/VIIa

IL SISTEMA DELLA FIBRINOLISI L’attivatore del Plasminogeno (tPA), assieme al plasminogeno si lega alla fibrina portando alla formazione di Plasmina

Anticoagulanti endogeni Antitrombina III: proteina prodotta dal fegato inibisce l’attività di IXa, Xa, XIa, XIIa e della trombina attivata dall’eparina Eparina: Polisaccaride solforilato prodotto dai mastociti attiva l’antitrombina III mediante modifiche conformazionali Usato in terapia  inibitore della coagulazione rapido e potente Trombomodulina: Glicoproteina esposta sulla superficie delle cellule endoteliali Lega la trombina alla proteina C Protein C: Serina proteasi contenente Gla Degrada i fattori Va e VIIIa Stabilizzata dalla proteina S Proteina S: Cofattore che stabilizza la proteina C attivata Inibitore del fattore tissutale Inibisce l’attivazione dei fattori IX e X da parte del fattore VIIa

sostanze ad azione anticoagulante Al di fuori del circolo il sangue può essere mantenuto liquido rimuovendo tutto il fibrinogeno oppure aggiungendo sostanze anticoagulanti Si distinguono due gruppi di sostanze ad azione anticoagulante: 1) sostanze chelanti il calcio, che di fatto sottraggono il calcio alla cascata coagulativa: citrato ossalato EDTA (acido etilendiaminico tetracetico) sotto forma di sali di sodio e di potassio 2) inibitori della trombina: eparina: esalta l’attività antitrombinica dell’antitrombina III (AT III)

4.fase fibrinolitica Il sistema fibrinolitico è fisiologicamente preposto alla dissoluzione dei trombi e dei coaguli di fibrina Tale compito è svolto dalla plasmina, un potente enzima (proteasi) che viene generata da un precursore ematico inattivo, il plasminogeno, attivato dal t-PA (attivatore tessutale del plasminogeno), prodotto dalle cellule endoteliali

Test di laboratorio Attualmente è molto più facile caratterizzare laboratoristicamente i difetti che causano emorragia piuttosto che quelle situazioni, potenzialmente curabili, che predispongono alla trombosi

Livelli di interventi del laboratorio Anamnesi Esami diagnostici di base Esame obiettivo di laboratorio Esame fisico Esami d’urgenza Esami diagnostici di approfondimento DECISIONE CLINICA Esami di monitorggio Decorso Farmaci Tossici

manifestazioni cliniche associate a deficit dell’emostasi - petecchie: piccole emorragie capillari con diametro di circa 1-2 mm di colorito rosso violaceo, frequenti nelle zone dove maggiore è la pressione idrostatica o dove c’è pressione o frizione esterna - porpore: emorragie con diametro  3 mm costituite da un insieme di petecchie ecchimosi: versamenti emorragici sottocutanei di diametro tra 1 e 2 cm, inizialmente di colore rosso-blu, poi verde-blu e quindi giallo-oro ematomi: versamenti emorragici profondi che spesso dissecano le fasce muscolari; possono avere esiti clinicamente insignificanti (lividi) così come gravissimi, finanche mortali (versamento retroperitoneale da dissecazione di un aneurisma dell’aorta) versamenti ematici in cavità dell’organismo: emotorace, emopericardio, emoperitoneo, emartro sanguinamenti da determinati distretti dell’organismo: gengivorragia, epistassi, ematemesi, melena, ematuria, menorragia e metrorragia

Bilancia emostatica Ipercoagulabilità Normale Ipocoagulabilità Emorragie Trombosi

Significato della raccolta della storia clinica Il più importante test di screening è la raccolta della storia familiare e personale accurata. E’ noto infatti che i reagenti necessari ai test di screening non sono così sensibili a tutti i difetti dell’emostasi. Per questo motivo possiamo trovare delle situazioni nelle quali, pur essendo i test nella norma, esiste una chiara storia emorragica, per lo più in seguito a traumi e/o estrazioni dentarie

Significato della raccolta della storia clinica Un’altra situazione nella quale una adeguata raccolta della storia clinica può impedire erronee valutazioni basate sui test di screening è l’errata esecuzione del prelievo sul quale si effettuano poi i test di laboratorio. Può infatti accadere che durante l’esecuzione, la raccolta e la conservazione del prelievo, l’emostasi venga attivata e questo produrrà degli artefatti nel test di screening, capaci a volte di mascherare un lieve difetto emostatico, o di dare una impressione di ipercoagulabilità inesistente.

La raccolta della storia clinica va eseguita seguendo lo schema orientativo riportato nella tabella

Considerazioni sulla raccolta della storia clinica E’ importante stabilire: L’eventuale insorgenza di sintomi emorragici e la loro incidenza familiare: la presenza di sintomi dalla nascita o dalla prima infanzia e la loro familiarità, orientano verso alterazioni della coagulazione, mentre i difetti della fase vasopiastrinica ( con esclusione della malattia di von Willebrand) sono in genere acquisiti e sporadici. La molteplicità delle sedi delle emorragie: è difficile che in presenza di alterazioni dell’emostasi la sede di emorragia sia unica

Processo diagnostico del paziente con patologie di pertinenza ematologica Esame obiettivo Cute: pallore, cianosi, ittero, petecchie, ecchimosi, noduli, teleangectasie, lesioni da grattamento Occhi: pallore o ittero delle congiuntive, emorragie retiniche, essudati retinici, ectasia dei vasi retinici 3.Cavo orale: stomatiti, ulcerazioni necrotiche, porpora, bolle emorragiche 4.Stazioni linfonodali: adenomegalie e loro caratteristiche 5.Torace: versamenti pleurici, focolai infettivi, dolore alla pressione dello sterno o delle costole

Alterazione dell’emostasi primaria: porpora

Alterazione dell’emostasi primaria: ecchimosi

Alterazione dell’emostasi secondaria: emorragie

Alterazione dell’emostasi secondaria: emorragie

Alterazione dell’emostasi secondaria acquisite

Alterazione dell’emostasi secondaria acquisite

Test di uso comune per valutare la coagulazione Valutazione fase piastrinica Emocromo  conta piastrinica tempo di stillicidio Tempo necessario per la formazione del tappo piastrinico in seguito a puntura standardizzata aggregazione piastrinica Ristocetina  Antibiotico che induce l’aggregazione piastrinica in presenza di vWf Valutazione fase fibrinica PT aPTT dosaggio fibrinogeno dosaggio At-III dosggio D-dimero dosaggio fattori: Ratio attività:antigene

Test di screening dell’emostasi Test di primo filtro: sono test che permettono con buona probabilità di evidenziare la maggiore e più importante parte dei difetti emostatici Test di secondo filtro: vanno ad indagare dei difetti più rari, ma non per questo meno importanti

Caratteristiche dei test di primo filtro Sono test di screening e per questo devono essere : Semplici, perché devono essere alla portata di ogni laboratorio non specializzato Sensibili, così da rilevare non solo le più grossolane anormalità dell’emostasi, ma anche difetti minori, che peraltro aumentano notevolmente il rischio emorragico in seguito ad un intervento chirurgico Limitati di numero, in quanto il loro scopo è quello di mettere in evidenza il più velocemente possibile alterazioni delle fasi della coagulazione

Test di screening dell’emostasi Test di primo filtro: tempo di emorragia e conta piastrinica (esplorano la fase vasopiastrinica), il tempo di protrombina, il tempo di tromboplastina parziale attivato (esplorano la fase della coagulazione) Test di secondo filtro: dosaggio del fattore XIII, dell’a 2 antiplasmina, del tPA e del PAI, del fattore piastrinico 3, del tempo di trombina, il tempo di Reptilase e del wWF

Test di primo filtro: fase vasopiastrinica Tempo di emorragia: E’ il tempo necessario all’arresto del sanguinamento da un piccolo taglio, di dimensioni standardizzate, provocato sulla superficie cutanea (varia da 1 a 9 minuti) Cosa valuta? L’interazione delle piastrine con la parete vascolare, e la successiva formazione del tappo emostatico primario Quando è prolungato? In tutti i casi di piastrinopenia e piastrinopatie, in caso di carenza di alcuni fattori plasmatici (quali il fibrinogeno e il vWF), essenziali per la normale funzione piastrinica ed in soggetti con alterazione della parete vascolare (sindrome di Ehelers-Danlos, telengectasia emorragica Come si esegue? Esistono diversi metodi. Tutti sono modifiche di due tecniche: quella di Duke, che prevede l’incisione del lobo di un orecchio, e quella di Ivy, in cui si esegue un’incisione della cute dell’avambraccio, mantenendo costante la pressione ematica (40 mm Hg) mediante un manicotto

Bleeding Time Incisione 1 mm x 5 mm Pressione costante Range 2 - 10 minuti 40 mm

Condizioni che possono alterare il tempo di sanguinamento Il tipo, la lunghezza la profondità dell’incisione L’assunzione di farmaci tra cui l’acido acetilsalicilico (è stata descritta una sindrome di disfunzione piastrinica caratterizzata da un tempo esageratamente allungato dopo assunzione di acido acetilsalicilico ed un tempo di emorragia basale normale) ed altri antinfiammatori

Test di primo filtro: fase vasopiastrinica 2.Conta delle piastrine. Il conteggio delle piastrine Non è strettamente indispensabile per una prima valutazione dell’emostasi purchè venga eseguito il tempo di emorragia. Generalmente esiste una correlazione inversa fra il numero di piastrine al di sotto di 100.000/ul e il tempo di emorragia Il conteggio delle piastrine diventa obbligatorio quando il tempo di emorragia è prolungato per stabilire se si tratta di piastrinopenia o di piastrinopatia. E’ importante ricordare che si possono avere piastrinopenie spurie (o pseudopiastrinopenie) causate dall’EDTA, l’anticoagulante in cui vengono generalmente raccolti i campioni di sangue per la conta piastrinica. Ciò probabilmente è dovuto ad immunoglobuline che agglutinano le piastrine quando il Ca è chelato.

indagini di laboratorio per la valutazione della funzionalità piastrinica e relativi valori di riferimento - tempo di sanguinamento:  10 minuti (nei soggetti normali tra 3-6 minuti) - conteggio delle piastrine: 150.000 – 400.000 per L - test di adesività piastrinica: > 70% - test di aggregazione piastrinica: confronto dei tracciati di trasmittanza con quelli ottenuti su piastrine normali

tempo di sanguinamento Il tempo di sanguinamento (o di emorragia) viene determinato effettuando una piccola incisione superficiale sulla rete capillare della faccia volare dell’avambraccio, in una zona pulita, esente da malattie della pelle e lontano dalle vene superficiali, mantenendo una pressione venosa costante di 40 mmHg con uno sfigmomanometro e cronometrando la durata della fuoriuscita del sangue dalla ferita Il test viene eseguito in maniera accuratamente standardizzata provocando una incisione di profondità e lunghezza costante con una lama calibrata o con un bisturi automatico: i pazienti con un tempo di sanguinamento superiore ai 10 minuti presentano un rischio emorragico aumentato

conteggio delle piastrine 150.000 - 400.000 / L: valori normali > 100.000 / L: i pazienti sono asintomatici e il tempo di sanguinamento rimane nella norma 50.000 - 100.000 / L: il tempo di sanguinamento è lievemente allungato, ma senza alcuna sintomatologia emorragica < 50.000 / L: si osservano porpore cutanee dopo traumi minimi e sanguinamenti a livello mucoso in seguito a piccoli interventi chirurgici < 20.000 / L: notevole rischio di sanguinamenti spontanei intracranici e in altri sede interne

+ Platelet Aggregation Platelet Rich Plasma (PRP) Aggregating Reagent Aggregate Clumping Baseline Light Transmission Increased Light Transmission +

Typical Biphasic Pattern 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 Platelet Rich Plasma Poor Secondary Response (Release) Primary Response Injection Point Lag

Medicina di laboratorio Falsa piastrinopenia (pseudopiastrinopenia) Medicina di laboratorio Coagulazione e sangue

test di adesività piatrinica Il test di adesività piastrinica misura la capacità delle piastrine di aderire ad una superficie estranea Viene effettuato facendo passare, in condizioni controllate, il sangue attraverso un tubicino di plastica contenente microsfere di vetro e determinando il numero di piastrine trattenute rispetto a quelle presenti nel sangue dello stesso paziente non trattato Il risultato viene espresso in percentuale di piastrine trattenute; i valori normali sono tra 70 e 98%

Test di primo filtro: Fase coagulativa Tutti i test di coagulazione dipendono in modo fondamentale dalla quantità di campione di plasma ottenuto Si richiede una puntura venosa Il citrato è l’anticoagulante utilizzato routinariamente Il plasma citrato essenzialmente privo di piastrine viene preparato per centrifugazione standard

PT e aPTT aPTT  fosfolipidi, Ca++ ,silice. Normale: 31-55 sec Per i test coagulativi occorre sempre lavorare con il plasma aPTT  fosfolipidi, Ca++ ,silice. Normale: 31-55 sec PT  tromboplastina (PL + TF), Ca++. Normale: 10-16 sec

Tempo di protrombina (PT) Identifica i deficit acquisiti o congeniti dei fattori VII, X, V, protrombina (II) e fibrinogeno (I). Monitoraggio della terapia anticoagulante orale con dicumarolici (INR)  inibiscono l’attivita’ dei fattori VII, IX, X e della protrombina. PT corto  privo di significato patologico PT lungo  epatopatia. deficit vitamina K CID sindrome nefrosica Farmaci  dicumarolici

tempo di protrombina (PT) o tempo di Quick Questo test valuta l’efficacia della via estrinseca e comune della coagulazione (fattori I, II, V, VII e X) Si esegue aggiungendo al plasma-citrato del paziente tromboplastina tessutale e ioni calcio, e cronometrando il tempo necessario alla formazione del coagulo I valori sono normalmente espressi in secondi (v.n. tra 11 e 13 secondi) o come rapporto (ratio) tra il tempo del plasma in esame e quello di un campione di plasma normale di controllo

INR = PT Standardisation ISI Patient’s PT in Seconds Mean Normal PT in Seconds INR = INR = International Normalized Ratio ISI = International Sensitivity Index The INR is calculated by the formula shown on this slide. The ISI is the International Sensitivity Index. Each thromboplastin is assigned an ISI which reflects the sensitivity of the thromboplastin to Warfarin-mediated reduction of the Vitamin K dependent clotting factors. By convention, the ISI of the reference thromboplastin is 1.0. The higher the ISI, the less sensitive the thromboplastin is to Warfarin-mediated reduction of the Vitamin K dependent clotting factors. The next two slides provide an example of how the ISI (sensitivity) of the thromboplastin influences the PT ratio (PTR) and how the resulting variability is corrected by expressing the results as an INR.

PT si allunga per livelli di fattore Fatt. VII < 50% Fatt. V < 50% Fatt. X < 50% Fatt.II < 30% Fibrinogeno < 100 mg/dL Paraproteine Cause di errore Policitemia Prelievo difficile Provetta non riempita correttamente Contaminazione eparina Latenza fra prelievo ed esecuzione test > 2 ore

How Different Thromboplastins Influence the PT Ratio and INR Patient’s PT (Seconds) Mean Normal (Seconds) Thromboplastin reagent PTR ISI INR A 16 12 1.3 3.2 2.6 B 18 12 1.5 2.4 2.6 C 21 13 1.6 2.0 2.6 This slide is similar to the last one, but the results of the ISI values of the five thromboplastins and the corresponding INR values are added. It is clear that the marked variability of the PTR is normalized by expressing the results as an INR. D 24 11 2.2 1.2 2.6 E 38 14.5 2.6 1.0 2.6

Tempo di tromboplastina parziale attivato (aPTT) Identifica i deficit acquisiti o congeniti dei fattori IX, VIII, e XI Monitoraggio della terapia con eparina Test di screening per LAC Identifica con minor sensibilita’ del PT deficit dei fattori X, V, protrombina (II) e fibrinogeno (I) aPTT corto privo di significato patologico aPTT lungo deficit di fattori presenza di inibitori (anti-fattore VIII, LAC) terapia con eparina

tempo di tromboplastina parziale attivata (aPTT) Questo test valuta l’efficacia della via intrinseca e comune della coagulazione (fattori I, II, V, VIII, IX, X, XI, XII) Si esegue aggiungendo al plasma-citrato del paziente agenti attivanti (caolino), una emulsione di fosfolipidi (sostituti piastrinici) e ioni calcio, e cronometrando il tempo necessario alla formazione del coagulo I valori sono normalmente espressi in secondi (v.n. tra 28 e 40 secondi) o come rapporto (ratio) tra il tempo del plasma in esame e quello di un campione di plasma normale di controllo

Terapia con eparina: esalta l’attività anticoagulante dell’AT III, inibisce II, X e delle proteasi in genere Malattie epatiche: quadro complesso spesso si osserva un aumento del fattore VIII (è sintetizzato dal sistema reticoloendoteliale epatico) e del vWF

aPTT si allunga per livelli di fattore VIII < 50% XI < 50% IX < 30% XII < 30% Fibrinogeno < 100 mg/dL Livelli di eparina 0.15-0.2 U/mL Cause di errore Policitemia Prelievo difficile Provetta non riempita correttamente Contaminazione eparina Latenza fra prelievo ed esecuzione test > 2 ore