Cariotipo umano 1956 Accertamento del no. di cromosomi, i 23 cromosomi dell’assetto aploide vengono suddivisi in 7 gruppi (A-G) sulla base delle dimensioni e della posizione del centromero 1970 Introduzione delle tecniche di bandeggio: diventa possibile individuare i singoli cromosomi Braccio corto = p Braccio lungo = q Le bande vengono numerate con numeri progressivi dal centromero verso i telomeri

Cariotipo umano di un individuo di sesso maschile

Cariotipo umano di un individuo di sesso femminile

Bandeggio di un cromosoma umano a diversi livelli di risoluzione

UN PO’ DI NOMENCLATURA 46, XX cariotipo normale femminile 46, XY cariotipo normale maschile Anomalie di numero 45, X 47, XX +21 47, XXX Anomalie di struttura delezioni 46, XY, del(4)(p16.3) 46, XX, del(5)(q13q33) inversioni 46, XY, inv(11)(p11p15) duplicazioni 46,XX, dup(1)(q22q25) inserzioni 46, XX, ins(2)(p13q21q31) traslocazioni reciproche 46, XX, t(2;6)(q35;p21.3) traslocazioni Robertsoniane 45, XY, der(14;21)

Genoma umano aploide ca. 3000 Mb (= 3 x 109 bp) Cromosoma X ca. 155 Mb pari al 5% del genoma aploide, contiene più di 1000 geni molti dei quali housekeeping Cromosoma Y ca. 60 Mb pari al 2% del genoma aploide, contiene qualche decina di geni per lo più coinvolti nella formazione del testicolo e nella produzione di spermatozoi

Due zone di omologia X-Y poste alle due estremità dei cromosomi, vengono indicate con la sigla PAR (Pseudo Autosomal Region) PAR1 (o primaria) estremità del braccio corto, è grande ca. 2.6 Mb PAR2 (o secondaria) estremità del braccio lungo, è grande ca. 320 Kb Queste due regioni, durante la meiosi maschile, si appaiano e vanno incontro a ricombinazione PAR1 PAR2

Perché si è ipotizzato l’esistenza di un meccanismo di compensazione del dosaggio genico (o più precisamente della differenza di dosaggio genico)? Le aneuploidie dei cromosomi sessuali, a differenza di quelle a carico degli autosomi, sono compatibili con la vita, e, in alcuni casi, non comportano fenotipi anormali 47, XXX femmine normali, talvolta sterili 47, XXY (sindrome di Klinefelter) maschi sterili, talvolta con lieve ritardo mentale 45, X0 (sindrome di Turner), statura inferiore alla media, sterilità, altre anomalie di sviluppo generalmente non gravi 48, XXXX o XXXY sintomatologia più grave delle precedenti, ma comunque condizione compatibile con la vita La quantità di prodotto genico di geni del cromosoma X è uguale in maschi e femmine, nonostante il fatto che i maschi abbiamo una sola copia del gene e le femmine due Esempio attività enzimatica della G6PD (Glucosio-6-Fosfato Deidrogenasi)

Nei mammiferi, a differenza che in altri organismi (es Nei mammiferi, a differenza che in altri organismi (es. Drosophila), la compensazione del dosaggio genico è raggiunta attraverso l’inattivazione di uno cromosoma X nelle cellule somatiche che ne contengono due In cellule con aneuploidie dei cromosomi sessuali viene mantenuto attivo un solo cromosoma X, questo spiega il fenotipo pressoché normale di soggetti con cromosomi sessuali in eccesso o in difetto Agli inizi degli anni ’60 Mary Lyon ed Ernest Beutler sono arrivati in modo indipendente a dimostrare l’esistenza dell’inattivazione del cromosoma X Beutler studio del gene Gd nell’uomo Lyon studio di un gene che controlla il colore del pelo nel topo

Caratteristiche del cromosoma X trascrizionalmente inattivo: L’inattivazione è: casuale (in media il 50% delle cellule inattiva l’X ereditato dal padre e il 50% quello ereditato dalla madre) mantenuta clonalmente (le cellule figlie mantengono lo stesso pattern di inattivazione della cellula madre) precoce Caratteristiche del cromosoma X trascrizionalmente inattivo: mantiene attive alcune regioni (le due PAR ed altri geni interspersi in regioni inattive) assume un aspetto eterocromatico in interfase (corpo di Barr) acquista le caratteristiche del DNA inattivo (metilazione dei residui di Citosina, ipoacetilazione degli istoni, replicazione del DNA nella tarda fase S)

In cellule euploidi o con aneuploidie dei cromosomi sessuali, in interfase sono visibili 0, 1, 2 o 3 corpi di Barr a seconda del numero di cromosomi X presenti nella cellula Il corpo di Barr è stato scoperto alla fine degli anni ’40 e, quando è stata scoperta l’inattivazione del cromosoma X, si è ipotizzato che potesse essere l’espressione morfologica dell’X inattivo Corpo di Barr  struttura eterocromatica visibile in interfase addossato alla parete interna della membrana nucleare

Nucleo di una cellula in interfase con 1 corpo di Barr Nucleo di una cellula in interfase con 3 corpi di Barr

Come avviene l’inattivazione? Processo multi-step: ‘conteggio’ dei cromosomi X presenti nella cellula (anche rispetto agli autosomi); ‘scelta’ del(dei) cromosoma(i) X da inattivare, uno per ogni assetto diploide; inizio dell’inattivazione; sua diffusione alla quasi totalità del cromosoma; mantenimento dello stato inattivo l’inattivazione non è sequenza-specifica (sequenze autosomiche traslocate sull’X possono essere inattivate) Tutte queste funzioni sono mediate da sequenze di DNA che si trovano nella regione Xq13 e da loci autosomici

XIST (X Inactive Specific Transcript) La regione Xq13 contiene quindi l’X-Inactivation Center (XIC), questa regione è stata suddivisa in sottoregioni coinvolte nei singoli step del processo di inattivazione inizio anni ’90  identificazione del primo gene coinvolto nell’inattivazione XIST (X Inactive Specific Transcript) è l’unico gene espresso solo dal cromosoma X inattivo codifica un RNA senza ORF di ca. 17 Kb che sembra rivestire il cromosoma X inattivo Attualmente sono stati identificati altri geni necessari per il processo di inattivazione, ma le basi molecolari di questo fenomeno non sono ancora completamente note

L’inattivazione è sempre casuale? NO si osserva deviazione dalla casualità quando uno dei cromosomi X della cellula porta una copia del gene XIST (necessario per dare inizio all’inattivazione) non funzionante o quando si ha una traslocazione bilanciata X-autosoma. In questi casi l’inattivazione è in origine casuale, ma le cellule che inattivano l’X coinvolto nella traslocazione inattiveranno anche geni autosomali e questo le renderà selettivamente svantaggiate rispetto alle altre cellule

Pattern di inattivazione nelle cellule della linea germinale: entrambi i cromosomi X degli oogoni sono attivi, l’unico cromosoma X degli spermatogoni è inattivo

L’inattivazione del cromosoma X è responsabile della grande variabilità clinica delle malattie dovute a geni che mappano su questo cromosoma  la gravità del fenotipo clinico dipenderà dalla proporzione di cellule che hanno mantenuto attivo il cromosoma X con l’allele mutante

Espressione monoallelica di geni biallelici Imprinting genetico Espressione differenziale di materiale genetico a seconda che esso sia stato trasmesso dal padre o dalla madre. I geni soggetti a imprinting sono presenti in duplice copia, ma di essi viene espressa una sola copia Espressione monoallelica di geni biallelici

Concetto contrario alle leggi di Mendel secondo le quali l’origine materna o paterna di un’informazione non ne influenza l’espressione (equivalenza degli incroci reciproci) Geni ‘imprintati’ nel padre sono silenziati durante la spermatogenesi  la copia fornita dal padre non viene espressa, rimane attiva solo quella fornita dalla madre Geni ‘imprintati’ nella madre sono silenziati durante la oogenesi  la copia fornita dalla madre non viene espressa, rimane attiva solo quella fornita dal padre

pedigree di una malattia dovuta ad un gene soggetto a imprinting silenziato durante la oogenesi (è attiva solo la copia fornita dal padre) il rapporto maschi : femmine tra gli affetti è 1:1, una femmina malata non trasmette MAI la malattia, che può ricomparire però nei suoi nipoti (figli dei suoi figli maschi)

PROVE DELL’ESISTENZA DELL’IMPRINTING esperimenti di trapianti di pronuclei nel topo: creazione di zigoti androgenetici e ginogenetici zigoti ginogenetici 2n cromosomi TUTTI di derivazione femminile embrioni abortivi – strutture extraembrionarie pressoché assenti, embrione quasi normale zigoti androgenetici 2n cromosomi TUTTI di derivazione maschile embrioni abortivi – iperplasia del trofoblasto, embrione pressoché assente CONTROLLI zigoti normali ottenuti con trasferimento di pronuclei 2n cromosomi, n forniti da un maschio e n da una femmina embrioni normali – la manipolazione di per sé non impedisce il normale sviluppo

PROVE DELL’ESISTENZA DELL’IMPRINTING NELL’UOMO Esistono due patologie umane paragonabili agli zigoti ginogenetici e androgenetici: teratomi, 2n cromosomi forniti SOLO dalla madre mole idatiforme, 2n cromosomi forniti SOLO dal padre I triploidi (3n cromosomi = 69) sono tutti abortivi, ma il fenotipo dei 2nP1nM è diverso da quello dei 2nM1nP, nei primi si osserva un’iperplasia delle strutture extraembrionarie e assenza dell’embrione vero e proprio, viceversa, nei secondi si hanno strutture extraembrionarie quasi assenti e embrione pressoché normale Alcune disomie cromosomiche uniparentali (UPD) (entrambi i cromosomi di una coppia forniti dallo stesso genitore) hanno effetti fenotipici diversi dettati dal sesso del genitore che ha fornito la coppia di cromosomi

Si stima che nell’uomo i geni soggetti a imprinting siano dell’ordine di 200, si trovano sulle seguenti regioni cromosomiche: 6, 7q, 11p, 14q, 15q11-q13, 20

molto spesso i geni soggetti a imprinting sono riuniti in cluster contenenti geni ‘imprintati’ nella madre e geni ‘imprintati’ nel padre i due cluster omologhi mostrano metilazione differenziale (ma non sempre la metilazione è a carico dell’allele non espresso) nei cluster sono in genere presenti sia geni strutturali (il loro prodotto finale è una catena polipeptidica) sia geni che producono RNA non codificanti

L’imprinting deve essere risettato ad ogni generazione

Sindrome di Beckwith-Wiedemann (BWS) (1) Malattia dovuta a un gene soggetto a imprinting nella madre (è attiva solo la copia fornita dal padre) causata da acquisizione di funzione. Il gene mappa in 11p15 P M Nei soggetti normali è espressa solo la copia paterna La duplicazione sul cromosoma paterno ha come conseguenza un raddoppiamento del prodotto genico ed insorgenza della malattia P M La duplicazione sul cromosoma materno è senza conseguenze perché la copia sovrannumeraria non viene espressa P M

Sindrome di Beckwith-Wiedemann (BWS) (2) Una mutazione nel centro di imprinting impedisce il silenziamento del gene in cis La mutazione è sul cromosoma paterno  non si hanno conseguenze fenotipiche perché la copia che non può essere spenta è comunque destinata ad essere espressa P M P M La mutazione è sul cromosoma materno  l’individuo è malato perché ha due copie attive del gene

Sindrome di Prader-Willi (PWS) - malattia dovuta ad assenza della funzione del ‘gene’ PWS (si tratta di vari geni che per semplicità vengono qui considerati come un unico gene), ‘gene’ soggetto ad imprinting nella madre (è espressa solo la copia fornita dal padre) che mappa in 15q11-13 Sindrome di Angelman (AS) - malattia dovuta ad assenza della funzione del gene AS, gene soggetto ad imprinting nel padre (è espressa solo la copia fornita dalla madre) che mappa in 15q11-13, cioè nella STESSA regione del ‘gene’ PWS Entrambe le malattie possono essere dovute a: delezione dell’intera regione cromosomica 15q11-13; disomia uniparentale (UPD) (materna nella PWS, paterna nella AS); errore di imprinting; solo per la sindrome di Angelman: mutazione nella copia materna del gene AS

Pattern di espressione nel soggetto normale: sono espressi il ‘gene’ PWS del cromosoma paterno ed il gene AS del cromosoma materno P M PWS AS P M La delezione è sul cromosoma Paterno  assenza della funzione del ‘gene’ PWS, si ha Sindrome di Prader-Willi La delezione è sul cromosoma Materno  assenza della funzione del gene AS, si ha Sindrome di Angelman P M

Disomia Uniparentale (UPD) Paterna  assenza funzionale del gene AS  Sindrome di Angelman PWS AS UPD Materna  assenza funzionale del ‘gene’ PWS  Sindrome di Prader-Willi M PWS AS mutazione nel centro di imprinting sul cromosoma P che non può essere risettato e viene trasmesso con un’impronta di tipo Materno  assenza funzionale del gene PWS  Sindrome di Prader-Willi P M PWS AS mutazione nel centro di imprinting sul cromosoma M che non può essere risettato e viene trasmesso con un’impronta di tipo Paterno  assenza funzionale del gene AS  Sindrome di Angelman P M PWS AS

UPD = UniParental Disomy = disomia uniparentale  entrambi gli omologhi di una coppia vengono ereditati dallo stesso genitore Non si ha un’alterazione quantitativa rispetto al normale, ma per quel particolare cromosoma l’informazione genetica proviene da un solo genitore Le UPD sono in genere dovute a recupero di una trisomia (un embrione trisomico che in una fase estremamente precoce dello sviluppo perde un membro della tripletta di omologhi)