CLONAGGIO DNA RICOMBINANTE: DUE MOLECOLE DI DNA VENGONO UNITE IN PROVETTA SFRUTTANDO LE PROPRIETA’ DI ENDONUCLEASI DI RESTRIZIONE DI TIPO II E DELLA DNA LIGASI CLONAGGIO -IN BIOLOGIA CLONARE UN ORGANISMO SIGNIFICA OTTENERE UN INDIVIDUO UNA POPOLAZIONE DI ORGANISMI CHE SONO GENETICAMENTE IDENTICI -IN BIOLOGIA MOLECOLARE CLONARE UN TRATTO DI DNA SIGNIFICA OTTENERE UNA POPOLAZIONE DI DNA IDENTICHE ALLA MOLECOLA DI PARTENZA

Il clonaggio del DNA Clonaggio: viene generata una molecola di DNA ricombinante, cioe’ isolata dal suo contesto e introdotta in un replicone (una unita’ di DNA capace di replicarsi detto vettore). Questa molecola di DNA ricombinante viene introdotta in un sistema cellulare appropriato (in genere batteri derivati dall’ Escherichia coli). Tutti i discendenti di questa singola cellula, detta clone, conterranno la medesima molecola di DNA ricombinante originariamente isolata, permettendo di produrne quantita’ praticamente illimitate

Plasmidi Molecole extracromosomiali di DNA circolare, capaci di replicarsi e di segregare autonomamente rispetto al DNA cromosomale dei batteri. Di solito sono portatori di geni che conferiscono ai batteri un vantaggio selettivo in particolari condizioni ambientali (resistenza agli antibiotici, ad es.) Possono ospitare DNA estraneo (a condizione che non sia troppo grande) Possono essere facilmente purificati dal DNA cromosomale in grande quantità.

Plasmidi

Plasmidi: Superavvolgimento Non digerito Digerito M 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1

- + Enzimi di restrizione Il DNA digerito con gli enzimi di restrizione può essere analizzato mediante elettroforesi Enzimi di restrizione Plasmide (P) - M P P+B P+E G+E Eco RI (E) 10 9 10 kb Bam HI (B) 8 7 6 Eco RI 5 DNA genomico (G) 3x 109 basi 4 3 2 + 1

- + MAPPATURA ENZIMATICA DI UN TRATTO DI DNA 6.6 bp PstI HindIII 1 2 3 4 + 0,5 PstI+HindIII 1.1 1.4 4.1 - 1.7 2.3 2.6 0.6 1.2 PstI HindIII 1.1 kb 0.6 kb 2.3 kb 1.2 kb 1.4 kb

Le DNA ligasi sono enzimi capaci di legare covalentemente due molecole di DNA adiacenti con estremità libere

EcoRI DNA RICOMBINANTE: due tratti di DNA che in natura non sono adiacenti, vengono uniti in provetta. Le proprietà degli enzimi di restrizione sono state essenziali per la tecnica del DNA ricombinante. I due tratti da unire vengono tagliati con uno stesso enzima di restrizione. EcoRI GAATTC CTTAAG G AATTC CTTAA G

Le estremità coesive prodotte da uno stesso enzima possono appaiarsi. G CTTAA AATTC GAATTC CTTAAG

Infine la DNA ligasi viene utilizzata per legare covalentemente le due molecole di DNA G AATTC CTTAA G 5’ 3’ OH P 5’ 3’ G CTTAA OH P AATTC DNA LIGASI ATP GAATTC CTTAAG 5’ 3’

Solo estremità compatibili possono essere legate efficientemente

INSERIMENTO DI UN TRATTO DI DNA ESOGENO IN UN VETTORE DI CLONAGGIO

CLONAGGIO: - LIGASI - TRASFORMAZIONE - SELEZIONE - CRESCITA COLONIE

BATTERICA DI INTERESSE IDENTIFICAZIONE DELLA COLONIA BATTERICA DI INTERESSE

Cosa può succedere in una reazione ligasica ? Il vettore si richiude su se stesso senza legarsi con l’inserto Il vettore si lega con l’inserto

L’enzima beta-galattosidasi può essere utilizzato per discriminare le colonie che contengono un plasmide con inserto da quelle che contengono un plasmide senza inserto

ALCUNI ENZIMI PRODUCONO ESTREMITA’ TRONCHE (BLUNT) ESTREMITA’ BLUNT POSSONO ESSERE LEGATE A ESTREMITA’ BLUNT PRODOTTE DA QUALSIASI ALTRO ENZIMA, NON CI SONO LE LIMITAZIONI IMPOSTE DALLA COMPLEMENTARIETA’ DELLE BASI DELLE CODINE APPICCICOSE. SVANTAGGIO: LIGASI DI ESTREMITA’ BLUNT E’ MENO EFFICIENTE PECHE’ NON SI HA APPAIAMENTO TRA CODINE A SINGOLO FILAMENTO. CCC/GGG GGG/CCC GAT/ATC CTA/TAG EcoRV SmaI CCC GGG ATC TAG LA SEQUENZA IBRIDA CHE SI FORMA NON E’ RICONOSCIUTA DA NESSUNO DEI DUE ENZIMI.

QUANDO E’ NECESSARIO UNIRE DUE ESTREMITA’ INCOMPATIBILI???? E’ POSSIBILE CONVERTIRE LE ESTREMITA’ STICKY IN ESTREMITA’ BLUNT Estremita’ 5’ protruding: 5’ 3’ 5’ 3’ L’estremità 3’ del filamento viene utilizzata come innesco dalla DNA POLIMERASI. Si utilizza il frammento Klenow della DNA polimerasi I di E. coli (DNA POLIMERERASI intera ha azione 5’esonucleasica). Estremità 5’ o 3’ protruding: 5’ 3’ 3’ 5’ Si utilizza la nucleasi S1: nucleasi che funziona su singolo filamento.

Il fago lambda come vettore di clonaggio

Il ciclo vitale del fago lambda

Placche di lisi

Lisogenia

Lisogenia

Ricombinazione sito-specifica

Ricombinazione omologa

Ciclo litico FASE PRECOCE FASE TARDIVA INFEZIONE Produzione di enzimi Per la sintesi del DNA FASE PRECOCE Inizia la replicazione Produzione di teste e code del fago FASE TARDIVA packaging lisi

Un interruttore complesso

Replicazione ‘rolling circle’ Packaging COS Genoma COS Genoma COS Genoma COS

Il fago lambda come vettore

Dimensione degli inserti contenuti nei principali vettori VETTORI PLASMIDICI -> 0-10 kb VETTORI l di inserzione -> 0-10 kb VETTORI l di sostituzione -> 9-23 kb VETTORI COSMIDICI -> 30-44 kb VETTORI PAC (crom. artif. P1) -> 130-150 kb VETTORI BAC (crom. artif. batt.)-> fino a 300 kb VETTORI YAC (crom. artif.lievito)-> 0.2-2 Mb

Cosmidi

P1

YAC