Dipartimento Agronomia Ambientale e Territoriale Istituto Sperimentale Colture Industriali - Sez. Rovigo Ottimizzazione dell’agrotecnica della canapa (Cannabis sativa L.) per applicazioni di tipo farmaceutico. Relatore: Prof. Dario Giambalvo Tesi di laurea di: Correlatori: Salvatore Casano Dott. Giampaolo Grassi Dott. Piero Trapani

La canapa è stata ampiamente coltivata sin dall’antichità L’Italia, agli inizi del XX secolo, era il maggior produttore (circa 100.000 ha) di fibra e seme di canapa in Europa L’attuale superficie nel mondo investita a canapa (da fibra e da seme) ammonta a circa 75.000 ettari (in Italia poco più di 1.000 ettari) Attuale rivalutazione della canapa in virtù delle sue molteplici utilizzazioni

Utilizzazioni Applicazioni farmaceutiche Fibra Cellulosa Solventi, vernici, saponi, lubrificanti, materie plastiche Biodiesel Cibo (per consumo umano e per l’alimentazione zootecnica) Integratori alimentari Biomassa da energia Oli essenziali Applicazioni farmaceutiche

POTENZIALI CAMPI DI IMPIEGO TERAPEUTICO DEI DERIVATI DELLA CANAPA A: Patologie per le quali esistono evidenze incontrovertibili: Trattamento della nausea in chemioterapia Stimolazione dell’appetito in pazienti con sindrome da deperimento Aids–correlata B: Patologie per le quali esistono promettenti evidenze preliminari: Terapia del dolore Effetti neuroprotettivi e antiossidanti (ictus e traumi cranici) Sindrome di Gilles de la Tourette Glioblastomi Artrite reumatoide Glaucoma Epilessia Sclerosi multipla (sollievo da dolore neuropatico)

Spray sub-linguale a % standardizzata di Δ9-THC e CBD il SATIVEX® è il primo farmaco contenente cannabinoidi ottenuti da estratti vegetali ad essere accettato dalla farmacopea ufficiale di un Paese occidentale Spray sub-linguale a % standardizzata di Δ9-THC e CBD Δ9-THC/CBD 1:1 E’ ottenuto dopo estrazione chimica, purificazione e titolazione di due varietà “monochemiotipiche”: una ricca in Δ9-THC e l’altra in CBD; entrambe sono caratterizzate da un elevato grado di purezza (circa 95 %) del cannabinoide principale rispetto ai secondari

POTENZIALI CAMPI DI IMPIEGO TERAPEUTICO DEI DERIVATI DELLA CANAPA C: Patologie in cui esistono evidenze meritevoli di ulteriori approfondimenti: Terapia dei tumori Lesioni midollari (tetraplegia, paraplegia) Malattie neurodegenerative (distonie, Parkinson, Huntington, Alzheimer) Asma bronchiale Malattie autoimmuni e patologie infiammatorie croniche (lupus eritematoso, morbo di Crohn, colite ulcerosa, etc.) Sindromi ansioso–depressive e altre sindromi psichiatriche Patologie cardiovascolari Sindromi da astinenza nelle dipendenze da sostanze Prurito intrattabile

I cannabinoidi più abbondanti nei tessuti vegetali sono: Gli effetti terapeutici della canapa sono dovuti alla presenza di p.a. appartenenti alla famiglia dei cannabinoidi (gruppo di composti a 21 atomi di C unicamente prodotti dal genere Cannabis); ad oggi ne sono stati identificati oltre 60, comprendendo anche i loro acidi carbossilici, analoghi e prodotti di trasformazione I cannabinoidi più abbondanti nei tessuti vegetali sono: Δ9-THC (delta9-tetraidrocannabinolo) CBD (cannabidiolo) CBC (cannabicromene) CBG (cannabigerolo) Δ9-THCV, CBDV e CBGV (omologhi propilici) Il CBG è il precursore di tutti i cannabinoidi e, per via enzimatica, viene convertito negli altri cannabinoidi principali

Classificazione dei fenotipi in base al contenuto in cannabinoidi Il Δ9-THC è il cannabinoide più studiato per gli effetti terapeutici, ma è dotato di attività psicotropa Il CBD modula l’attività del Δ9-THC attenuandone gli effetti collaterali e prolungandone l’effetto terapeutico 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 0,0 % Δ9-THC % CBD non psicotropo psicotropo semi-psicotropo Classificazione dei fenotipi in base al contenuto in cannabinoidi

L’Istituto Sperimentale Colture Industriali Sezione Operativa Periferica di Rovigo da alcuni anni si occupa di selezionare varietà di canapa monoiche e linee monochemiotipiche

Obiettivi della ricerca acquisire informazioni sulle principali caratteristiche di genotipi di canapa valutandone il comportamento in termini di parametri biometrici e, soprattutto, di concentrazioni % in cannabinoidi al variare di alcuni aspetti dell’agrotecnica CBD e CBG Δ9-THC esenti acquisire informazioni sulle variazioni del contenuto % in cannabinoidi nelle foglie durante il ciclo biologico della coltura

MATERIALI e METODI PROVA 1: 20 linee inbred L’attività di ricerca è stata articolata in due distinte prove: previamente e regolarmente autorizzate dal Ministero ai sensi dell’ art. 26 D.P.R. n° 309/90 (coltivazione di canapa a scopi sperimentali) PROVA 1: 20 linee inbred 4 pacchetti di coltivazione (substrato + concimazione) PROVA 2: 2 progenie clonali

Pacchetti di coltivazione in valutazione Substrato: mix di vari tipi di torba (in prevalenza torba nera) Concimazione: minerale (in prevalenza azotata in fase vegetativa e fosfo-potassica in fase di fioritura) T2 Substrato: fibra di cocco Concimazione: formulati minerali specifici forniti dalla ditta produttrice (Coco A e Coco B) T3 Substrato: torba bianca e compost di cortecce Concimazione: formulati minerali specifici forniti dalla ditta produttrice (Terra Vega – f. vegetativa e Terra Flores – f. fioritura) T4 Substrato: torba bianca e compost di cortecce Concimazione: formulati organici specifici forniti dalla ditta produttrice (Bio Vega – f. vegetativa e Bio Flores – f. fioritura)

Prova 1 – Linee inbred Sito: Monselice (PD) - presso una serra dell’Istituto Tecnico Agrario “Kennedy” Periodo: dal 2 agosto al 18 ottobre 2004 Semina: il 2 agosto in cubetti di torba pressata N° piante: 200 totali - 50 per trattamento Trapianto: dopo una settimana circa in vasi da 5 litri precedentemente invasati con i rispettivi substrati Illuminazione: dal trapianto fino al 14/9 (fase vegetativa): 18 ore di luce dal 14/9 alla raccolta (fase riproduttiva): 11 ore di luce Irrigazione: interventi giornalieri per mantenere il substrato sempre in condizioni prossime alla CIC Raccolta: il 18 ottobre (15-20 giorni d’anticipo rispetto al presunto ottimale)

Prova 2 – Progenie clonali Sito: Rovigo - presso una serra dell’Istituto Sperimentale per le Colture Industriali Periodo: dal 4 ottobre 2004 al 14 gennaio 2005 N° piante: 68 (24 clone E1 e 44 clone E7) - 17 per trattamento Trapianto: il 4/10 in vasi da 2 litri precedentemente invasati con i rispettivi substrati Illuminazione: dal trapianto fino al 2/11 (fase vegetativa): 18 ore di luce dal 2/11 alla raccolta (fase riproduttiva): 11 ore di luce Irrigazione: interventi giornalieri per mantenere il substrato sempre in condizioni prossime alla CIC Raccolta: il 14 gennaio 2005

Rilievi (a maturazione) Altezza delle piante Diametro del fusto Biomassa epigeica complessiva e ripartita nelle sue componenti (fusto, foglie, infiorescenze) Determinazione del contenuto in cannabinoidi nelle infiorescenze mediante analisi gas-cromatografica [L’estrazione è stata effettuata seguendo i metodi ufficiali UE (Reg. 796/2004); solvente (n-esano) e standard interno (squalene)]

Prova 1 – Linee inbred

Prova 1 – Linee inbred

Prova 1 – Linee inbred

Prova 1 – Linee inbred

Prova 1 – Linee inbred

Prova 1 – Linee inbred

Prova 1 – Linee inbred

Prova 2 – Progenie clonali

Prova 2 – Progenie clonali

Prova 2 – Progenie clonali

Prova 2 – Progenie clonali

Prova 2 – Progenie clonali

Conclusioni E’ stata riscontrata una ampia variabilità tra le linee in esame, che peraltro hanno mostrato una notevole stabilità di risposta al variare dei trattamenti applicati Sono state individuate linee stabili nel profilo chemiotipico e con elevato contenuto in CBD e CBG Le % in cannabinoidi più elevate sono state realizzate con i “trattamenti” caratterizzati da un limitato apporto di elementi fertilizzanti Il contenuto in percentuale in cannabinoidi si riduce progressivamente all’aumento della produzione di infiorescenze per pianta

Conclusioni Dal confronto tra le tesi T3 e T4, caratterizzate da uguale substrato ma da differenti tipologie di concime utilizzato, rispettivamente minerale ed organico, emerge come la produzione in CBD per pianta non è variata in modo significativo tra i due trattamenti La ricerca ha inoltre messo in evidenza un graduale decremento delle concentrazioni percentuali in cannabinoidi nelle foglie con il progredire della fase riproduttiva; ciò è presumibilmente collegato ai processi di senescenza delle foglie ma potrebbe anche essere legato a processi di traslocazione dei metaboliti verso le infiorescenze. Tale aspetto meriterebbe ulteriori approfondimenti sperimentali