Evoluzione di una tecnica che ha rivoluzionato la biologia molecolare Corso di laurea in Biotecnologie Biotecnoogie Diagnostiche La Real Time PCR Evoluzione di una tecnica che ha rivoluzionato la biologia molecolare Francesca Schena

Un po’ di storia... Test ad alta: SENSIBILITA’ SPECIFICITA’ 1983 Kary Mullis ideò la PCR 1993 premio Nobel

LA END-POINT PCR LIMITI: Poca precisione Bassa risoluzione No automazione Prodotti a basso p.m. Bromuro di etidio non è quantitativo ed è mutageno Risultati non numerici

Fasi di PCR in scala logaritmica QUANTIFICAZIONE NON E’ PRECISA A PLATEAU MA LO E’ NELLA FASE ESPONENZIALE

In una PCR con misurazione “end-point” (gel di agarosio) la quantità di ampliconi rilevato non è proporzionale alla quantità di target iniziale In una PCR “Real Time” il numero di cicli necessario per raggiungere una certa quantità di ampliconi è proporzionale alla quantità di target iniziale

Come funziona la Real Time? UTILIZZA DIVERSE SONDE INTERNE AL TARGET MARCATE A FLUORESCENZA CHE VENGONO RILEVATE DAI TERMOCICLATORI (FLUORIMETRI) DURANTE LA REAZIONE

Vantaggi della PCR Real Time Si evitano le contaminazioni date dalla manipolazione del campione Si riduce il tempo dell’esperimento Si ha una quantificazione del prodotto in tempo reale

La quantificazione del prodotto QUANTIFICAZIONE ASSOLUTA tramite curve standard a concentrazione nota QUANTIFICAZIONE RELATIVA tramite curve standard di un gene calibratore

SYBER GREEN

Perchè non scegliere SYBER Green Perchè scegliere SYBER Green Perchè non scegliere SYBER Green * Non sono richieste sonde specifiche * Generale screening di trascritti prima di passare alle sonde *Metodiche di pcr già collaudate in assenza di prodotti aspecifici, dimeri di primers ecc. * Genotipizzazione * Multiplex * Amplificazione di trascritti poco espressi * Detection di un basso livello di patogeni

Le sonde TaqMan Annealing Extension Extension REPORTER QUENCHER NON DETECTED EMISSION Annealing AMPLICON EXCITATION NON DETECTED EMISSION Extension AMPLICON EXCITATION Extension Spatial segregation of flurophores REPORTER QUENCHER TAQ POLYMERASE PHOSPHATE

Le sonde TaqMan Annealing Extension 5’-3’ Exonuclease REPORTER DETECTED EMISSION EXCITATION NON DETECTED EMISSION EXCITATION AMPLICON AMPLICON Annealing Extension 5’-3’ Exonuclease Spatial segregation of flurophores REPORTER QUENCHER TAQ POLYMERASE PHOSPHATE

VantaggiTaqman SvantaggiTaqman AFFIDABILITA’ COSTO ELEVATO SICUREZZA SEMPLICITA’ PRODUTTIVITA’ COSTO ELEVATO PROBLEMI DI ACCUMULO

MULTIPLEX SMART CYCLER Quattro canali ottici per la rilevazione della fluorescenza Possibile utilizzo di SYBR® Green, FAM, ROX, Cy3, Cy5, Texas Red, TET, Scorpion e Amplifluor primer

Molecular Beacon A target-specific loop EXCITATION DETECTED EMISSION B stem (5-6 complementary bases) AMPLICON EXCITATION Annealing Quenching C fluorophore REPORTER NON FLUORESCENT QUENCHER Same thing about segragation and spatial…. SI UTILIZZANO DI PREFERENZA CON L’APPARECCHIATURA NULISENS EASYQ

Vantaggi INNOVAZIONE: prima utilizzata per il monitoraggio di paziente HIV positivo approvata dalla FDA SEMPLICITA’ per l’interfaccia Windows che consente una facile interpretazione dei dati Svantaggi Massima precisione solo con RNA ottenuti da estrattori automatici Complessità della metodica

Sonde Fret Fluorescein (donor) LC RED640/705 (acceptor) Phosphate AMPLICON EXCITATION NON DETECTED EMISSION FRET DETECTED EMISSION EXCITATION 1-5nt AMPLICON Annealing Fluorescein (donor) LC RED640/705 (acceptor) Phosphate

Genotipizzazione tramite la curva di melting Sonda = 136 V AMPLICON 136V V AMPLICON WT A A V

Sonde fret e LIGHT CYCLER Ottimo in diagnostica Perchè molto veloce!!

Smart Cycler Nuclisens EasyQ Light Cycler + - ABI PRISM 7700 Termociclatore Tipo di sonda + - ABI PRISM 7700 Non versatile Set-up Ingombrante produttivo Syber green Economico Versatile Metodica collaudata Aspecificità Multiplex Tipizzazione Taqman/ Affidabile semplice Costoso Smart Cycler Set-up piccolo e pratico Taqman Molecular beacon Veloce (8 min) Flessibile Diagnostica Protocollo rigido Ricerca Nuclisens EasyQ Metodica complessa Light Cycler Fret Veloce Non per grossi volumi 7700 Applied Biosystems LightCycler Roche

Applicazioni Quantificazione virale Quantificazione dell’espressione genica Quantificazione del danno al DNA Controllo di qualita’ Efficacia e monitoraggio di una terapia Detection di patogeni Genotyping