UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI GENOVA CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE MEDICO-FARMACEUTICHE Biticchi Roberta

SEQUENZIAMENTO DEL DNA L’analisi di sequenze degli acidi nucleici rimane sempre il modo migliore per ottenere informazioni precise e definitive su di un gene. I laboratori impiegati nella ricerca sul genoma e nei test genetici eseguono tutti i giorni procedure di : sequenziamento ex novo, sequenziamento comparativo, mapping, rilevazione di mutazioni. Tecniche Le prime tecniche di sequenziamento del DNA sviluppate sono il metodo chimico di Maxam e Gilbert e quello enzimatico di Sanger.   METODO VANTAGGI SVANTAGGI CHIMICO Non ci sono interferenze da parte di alcune strutture secondarie che si possono formare sul DNA da sequenziare; - Non è necessario utilizzare un innesco (primer); - Consente di sequenziare anche oligo piuttosto piccoli. - È più accurato - È molto laborioso (doppio tratta- mento per ogni ottocampione); - Difficoltà nell’automatizzazione; - Bassa risoluzione. - Reagenti tossici Richiesta maggior quantità di DNA. ENZIMATICO Ogni sottocampione è trattato una volta sola, quindi essendo meno laborioso è anche più rapido; - Più facilmente automatizzabile; - Si possono esaminare più campioni contemporaneamente; - Miglior risoluzione. - Minori richiesta di DNA La polimerasi si blocca e si può staccare dallo stampo. Questo causa degli oligo con estremità non deossi (falsi stop) e causano la lettura di una base inesistente. - Subcloning in vettori - Accuratezza legata all’enzima utilizzato.

CYCLE SEQUENCING Marcatura Radioattiva Gel di Sequenza Il sequenziamento affidabile dei prodotti di PCR si ottiene con il cycle sequencing. Il DNA viene amplificato con una DNA polimerasi termostabile a partire da un unico primer di sequenza in prsenza di dideossinucleotidi (ddNTPs) che bloccano la polimerizzazione a livello di basi specifiche. Marcatura Radioattiva Primer o dNTPs marcati P32, P33, S35 Gel di Sequenza “slab” gel di poliacrilammide (dal 4% al 6%) molto sottili in condizioni denaturanti (Urea) per evitare la rinaturazione del DNA che modificherebbe la velocità di corsa Apparati verticali di lunghezza variabile a seconda del numero di basi da leggere (22 cm -1 m) Il forte campo elettrico a cui vengono sottoposti i campioni produce calore di 70°C Colorazione Silver Staining Evidenzia direttamente su gel le bande, senza ulteriori modificazioni, attraverso la precipitazione di Ag

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Sequenziatori Automatici Uno dei più importanti sviluppi nel sequenziamento del DNA, è stata l'introduzione di apparecchiature automatiche per l'elettroforesi e l'analisi dei prodotti di sequenza. La tecnologia del sequenziamento automatico prevede la rivelazione di frammenti di DNA, marcati in modo fluorescente man mano che si spostano lungo il gel elettroforetico che è irradiato da un laser. La fluorescenza emessa è raccolta da un detector. Il segnale risultante produce un pattern di bande che correla con una sequenza di DNA . Le apparecchiature per il sequenziamento automatico in fluorescenza consistono in genere di 3 moduli: Un modulo elettroforetico dotato di raggio laser, di una serie di fotodiodi e di un microscopio a fluorescenza o di una camera CCD per la rilevazione. Un modulo che ospita l'alimentatore per l'elettroforesi e per il laser Un computer IBM o Macintosh: con il software che permette di gestire il controllo del sistema, il display, l'analisi, l'elaborazione e la stampa dei dati . Sequenziatori a Gel Nei sequenziatori automatici che utilizzano slab gel, il lavoro manuale dell'operatore consiste esclusivamente nel portare a termine le reazioni, nel versare il gel (laddove non si usa un gel preformato) e nel caricamento dei campioni nei pozzetti.

SEQUENZIAMENTO AUTOMATICO Metodi di Marcatura Marcatura dei Primers progettati con “tag” colorati a Fluorescenza UV o Fluorescenza IR (minore background, maggiore sensibilità) 1 Colorante - 4 Corsie Per ogni campione si eseguono 4 reazioni di estensione separate (una per ogni ddNTP). L’uso di 4 corsie aumenta però la variabilità di corsa Marcatura dei Terminatori ddNTPs con fluorofori a differenti coloranti ddTTP ddATP ddGTP ddCTP 4 Coloranti - 1 Corsia Unica reazione ed unica corsa, ad ogni nucleotide è associata una diversa colorazione Questo sistema aumenta la produttività ed elimina la variabilità di corsa

SISTEMI DI RILEVAMENTO Microscopio a Fluorescenza A Fuoco Fisso Confocale Camera CCD ( Charge - Coupled Device) Altissima risoluzione immagine elettroferogramma. Sequenza in pochi minuti Assenza di Filtri Camera a Lettura Multipla Uso di qualsiasi colorante Doppio Laser Doppio Rilevatore Ad es. NIR o SBS

SOFTWARE ELETTROFEROGRAMMA Riassumendo Controlla e ottimizza i parametri elettroforetici Normalizza le bande Sottrae il background Corregge l’effetto “Smile” Adatta gli algoritmi se mobilità e spaziatura dei picchi escono dal range ELETTROFEROGRAMMA Riassumendo

APPLICAZIONI SEQUENZIAMENTO Sequenziamento Ex Novo Tecnica del “Chromosome Walking” Mapping Sequenziamento di Library Progetto Genoma Sequenziamento Ex Novo Uso di Primers Universali Es. M13 Tecnica del “Random Sequencing” Assemblaggio ed Allineamento delle sequenze tramite Computer Sfrutta l’ Overlapping dei vari frammenti

APPLICAZIONI SEQUENZIAMENTO Comparativa e/o Mutazionale Uso Diagnostico Applicazione non di routine Monitoraggio pazienti in terapia Test di Genotyping Es. HCV Implicazioni Terapeutiche

PROBLEMI Reazione fallita: non presenta picchi definiti e ha un alto rumore di fondo Campione che presenta rumore di fondo sufficientemente alto da causare ambiguità (N) nel riconoscimento dei picchi da parte del software

PROBLEMI Perdita di risoluzione precoce per cui i picchi sono sempre meno definiti Sequenza doppia dopo un tratto buono

PROBLEMI Sequenza fuori scala Regione ricca in GC

SEQUENZIATORI GLOBAL IR2 A Lettura Bidirezionale Rilevazione nell’infrarosso con bassissimo background e elevata sensibilità Lettura fino a 1400 basi con accuratezza del 99% Doppio Laser a Diodi Non necessita di preamplificazione o di elevata purezza del templato Il software recupera i dati, li controlla e li rende accessibili in rete Possibilità di usare anche terminatori marcati alternativamente ai primers

SEQUENZIATORI CAPILLARI Nei sistemi automatici in cui l'elettroforesi avviene nei capillari le procedure manuali sono praticamente inesistenti. Il sistema carica automaticamente il capillare con il polimero di corsa Esegue la separazione elettroforetica I frammenti marcati di DNA vengono rilevati man mano che corrono lungo il capillare 1 Capillare 16 Capillari 96 Capillari (Scala di Produzione) Richiede campioni privi di: Sali, molecole cariche negativamente, proteine, detergenti e templates non marcati.

TERMINATORI BIGDYE Sistemi a trasferimento di energia a singola molecola, costituiti da accettore e donatore legati da un linker Vantaggi: Segnale omogeneo, basso rumore di fondo, luminosità maggiore, facilità interpretativa per A e G attigue D A

CONCLUSIONI Il sequenziamento degli acidi nucleici rimane il miglior modo per ottenere informazioni precise e definitive su un gene Con l’introduzione del sequenziamento automatico si sono ridotte notevolmente: Le operazioni manuali per una migliore riproducibilità ed accuratezza Eliminazioni di sostanze nocive all’operatore Riduzione dei costi dei consumabili L’ introduzione dell’elettroforesi capillare con un sistema di rilevazione molto sensibile ha ridotto le quantità di DNA per campione rispetto al sistema a slab gel. Inoltre il vantaggio maggiore è rappresentato dall’eliminazione delle operazioni manuali, con il risultato di una maggiore riproducibilità ed affidabilità dei risultati.