METODI ALTERNATIVI PER LA RICERCA DEI MICROORGANISMI E PER LA VALUTAZIONE DELLA LORO VITALITA Prof. Antonello Paparella

1° gennaio 2006 entra in vigore il Regolamento CE 2073/05 sui criteri microbiologici applicabili ai prodotti alimentari

I PRIMI EFFETTI Sensibilizzazione dei laboratori Osservanza delle procedure analitiche Sensibilizzazione dei produttori Osservanza dei criteri microbiologici

VOLONTA DI CONFORMARSI AI CRITERI Può spingere il produttore ad adottare pratiche di decontaminazione su m.p. e p.f. Anomala estensione della shelf-life Danni subletali e falsi negativi Eventuali residui indesiderati

DECONTAMINAZIONE SUPERFICIALE DEI PRODOTTI ALIMENTARI Le soluzioni più frequenti: Acidi organici Etanolo Iperclorazione Radiazioni UV Vapore pressurizzato

UN CASO PARTICOLARE: DECONTAMINAZIONE DEI PRODOTTI IN INGRESSO NELLA CAMERA BIANCA

UNA LINEA DI DECONTAMINAZIONE SUPERFICIALE CON IPERCLORAZIONE DA UNA LINEA COME QUESTA, IN CONTATTO CONTINUO CON IPOCLORITO, E STATO ISOLATO…

un ceppo di Listeria monocytogenes con particolari performance adesive

Pratiche di decontaminazione inefficaci Cicli di congelam./scongelam. ripetuti POTREBBERO GENERARE FALSE NEGATIVITA nellanalisi microbiologica

per transizione delle cellule microbiche da uno stato coltivabile AD UNO STATO VITALE NON COLTIVABILE (VNC)

CELLULE VNC (VIABLE NOT CULTURABLE) Escherichia coli O157:H7 (Zhao and Matthews, 2000) Strategia di sopravvivenza in batteri non sporigeni. Dimostrata in Salmonella, Campylobacter, Escherichia, Vibrio, Streptococcus, Micrococcus ma anche in sporigeni come Bacillus subtilis. Riduzione volumetrica da forme coccobastoncellari a piccoli corpi sferici non dotati di involucri

LA CONDIZIONE VNC NON E LUNICA REAZIONE POSSIBILE ALLO STRESS CELLULARE esposizione a condizioni nutrizionali sfavorevoli, sostanze chimiche tossiche o condizioni fisiche subottimali (Neidhart e VanBogelen, 2000) STRESS NELLE CELLULE MICROBICHE

STATO FISIOLOGICO DELLE CELLULE ESPOSTE A STRESS

LE CELLULE MICROBICHE tra la vita e la morte… VITALI assenza di stress crescita regolare e vitalità cellulare STRESSATE stress lievecrescita rallentata o bloccata ma cellule vitali DANNEGGIATE stress moderatocrescita bloccata e diminuzione vitalità MORTE stress estremoinattivazione della maggior parte della popolazione ADATTATE ALLO STRESS stress superatorisposte adattative con > tolleranza allo stress SUICIDATE stress lieve/moderatoautolisi per > metabolismo futile

STRESS, ADATTAMENTO E SOPRAVVIVENZA AI PROCESSI DELLINDUSTRIA ALIMENTARE

DECONTAMINAZIONE E VNC Maggiore probabilità in caso di: Alimenti a shelf-life estesa (ESL) Criteri microbiologici severi in esportazione Alimenti con elevate cariche superficiali Alimenti con SL bloccata dalla distribuzione

STRATEGIE ANALITICHE IN SITUAZIONI A RISCHIO DI DECONTAMINAZIONE E VNC STRATEGIE ANALITICHE IN SITUAZIONI A RISCHIO DI DECONTAMINAZIONE E VNC

SE SI SOSPETTA UN FALSO NEGATIVO DA VNC Doppia procedura: arricchim. + resuscitation Doppia semina: con/senza disattivante Ricerca modificazioni substrato (inibenti, pH) Metodi specifici per VNC

METODI PER LA STIMA DEL DANNO MICROBICO SUBLETALE

Alla ricerca delle VNC… Metodi per stimare la vitalità cellulare DEFT (Jakobsen et al 1984; Ruocco et al 1991) Riduzione del 2,3,5-Trifeniltetrazolio (Chang et al 1999) Colorazione CTC-DAPI (Cappelier et al 1997) Bioscreen/Turbidometria(Phillips et al 1998;Paparella et al 2003) CO 2 detection time in GC (Guerzoni et al 1985) Citometria di flusso (Petrova e Donnelly, 2004)

STIMA DEL DANNO MICROBICO SUBLETALE NELLA BIOCONSERVAZIONE DEGLI ALIMENTI CON OLI ESSENZIALI

RIDUZIONE DEL 2,3,5- TRIFENILTETRAZOLIO STIMA DEL DANNO MICROBICO SUBLETALE

Studio del danno da olio essenziale in L.monocytogenes con riduzione del 2,3,5- trifeniltetrazolio cloruro (Paparella et al 2004) AGGIUNTA DI TTC AL TERRENO COLTURALE LIQUIDO: Riduzione del TTC (incolore, idrosolubile) formazano (rosso, insolubile) Valutazione quantitativa della vitalità cellulare (deidrogenasi) - usata in studi di fisiologia vegetale - Numerosi ceppi di L.monocytogenes sono stati esposti a diverse % olii essenziali. La Minimal Inhibitory Concentration (MIC) è stata valutata, in un primo screening, con TTC.

Studio del danno da olio essenziale in L.monocytogenes con riduzione del 2,3,5- trifeniltetrazolio cloruro (Paparella et al 2004)

Paparella et al 2004

CITOMETRIA DI FLUSSO STIMA DEL DANNO MICROBICO SUBLETALE

Doppia colorazione Secondo Ananta et al., 2004: Carbossifluoresceina diacetato (cFDA) Attività esterasica Propidio ioduro (PI) Propidio ioduro (PI) Danno di membrana

Determinazione in citometria di flusso Coulter®EPICS®XL (BeckmanCoulter Inc.): FLOW RATE: events/sec events/sample FL1 CHANNEL (525 ± 20 nm): FUORESCENZA VERDE (cF) FL2 CHANNEL (620 ± 15 nm): FLUORESCENZA ROSSA (PI)

Gate Fluorescenza delle cellule Possibile spiegazione del meccanismo cellulare coinvolto G1cF - and PI + Attività esterasica non rilevabile, membrana compromessa G2cF + and PI + Esterasi attiva,membrana danneggiata G3cF - and PI - Attività esterasica non rilevabile, membrana intatta G4cF + and PI - Esterasi attiva,membrana intatta Gate delle cellule colorate con cF e PI (Ananta et al., 2004)

Sottopopolazioni dopo doppia colorazione con cF e PI GATE 4 VITALI GATE 2 DANNEGGIATE GATE 1 INATTIVATE GATE 3 BASSA FLUORESCENZA FL1 CHANNEL: cF FL2 CHANNEL: PI

TURBIDOMETRIA/BIOSCREEN STIMA DEL DANNO MICROBICO SUBLETALE

4% NaCl O.D. (600 nm) Time (Hrs)

Effetto dellaggiunta di NaCl durante i trattamenti con differenti % OE Origano Time (Hrs) O.D. (600 nm) ATCC % NaCl

VALUTAZIONE DELLA PERMISSIVITA DEL SUBSTRATO

DECONTAMINAZIONE SUPERFICIALE DEI PRODOTTI A BASE DI CARNE MICROBIOLOGICAL CHALLENGE TEST E MODELLAZIONE DEI RISULTATI (L.monocytogenes)

PRODOTTI STUDIATI: Prodotti a base di carne: prosciutto crudo, coppa, lardo SCOPO: Decontaminazione superficiale in camera bianca (prima dellaffettatura) OBIETTIVO MICROBICO: Diminuzione dellinoculo (L. monocytogenes ATCC19114)

CHALLENGE TEST: Cocktail di 5 ceppi di L. monocytogenes: ATTC ceppi isolati da prodotti a base di carne (1 x 10 5 UFC/cm 2 ) DISEGNO SPERIMENTALE (E MODELLAZIONE): Effetto interattivo di NaCl, acido lattico e % olio essenziale sulla diminuzione logaritmica dellinoculo

Effetto dellaggiunta di NaCl durante il trattamento con differenti % olio essenziale di origano, con (a) o senza (b) emulsionante (lecitina) Logarithmic decrease (LogMPN) = 7,07x[EO] - 1,353x[NaCl] - 0,785x[NaCl] ,43x[Lactic Ac.] ,26x[EO]x[Lactic Ac.] + 13,87x[NaCl]x[Lactic Ac.] Logarithmic decrease (LogMPN) = 5,58x[EO] - 3,29x[Lactic Ac.] - 2,33x[EO] 2 - 1,39x[EO]x[NaCl] +3,03x[NaCl]x[Lactic Ac.]

NUOVE NORME PIU FLESSIBILI CONCLUSIONI SEMPRE PIU FREQUENTE LA DECONTAMINAZIONE RISCHIO DI FALSI NEGATIVI NELLANALISI MICROBIOLOGICA STRATEGIE E METODI GIA DISPONIBILI

Grazie per lattenzione! Prof. Antonello Paparella