BIOTECNOLOGIE FARMACOLOGICHE LEZIONE 14 CORSO DI LAUREA SPECIALISTICA IN BIOTECNOLOGIE DEL FARMACO Adriana Maggi

INSULATOR ( MAR ) INSULATOR ( MAR ) light luciferin + ATP = oxyluciferin + AMP + TK ERE 2x firefly luciferase +/- ERE-Luc reporter mouse The ERE-Luc reporter mouse: a model to study of ER transcriptional activity Ciana et al., 2001 ERE kinase-dependent activation

ERE-Luc mouse MDP E Estradiol ( pg /ml) day 1day 2day3day 4 S ESTRUS E 2 (pg/ml) MDPE Luciferase activity in adult, cycling females Ciana et al, Nature Ned., 2003

THE COMPLEXITY OF ESTROGEN ACTION ERE G-protein, IP3K... SP1 NFKB AP1 THE COMPLEXITY OF ESTROGEN TARGETS REPRODUCTIVE SYSTEM - male and female gonads - hypothalamus and pituitary SKELETAL SYSTEM VASCULAR SYSTEM - endothelium - smooth muscle cells RESPIRATORY SYSTEM IMMUNE SYSTEM NERVOUS SYSTEM - central - peripheral

CNS cardiovascular reproductive bone ERE SP1 NFKB AP1 tissue-specific coregulators growth factors P ER COMPLEXITY OF ACTION and A NEW CLASS OF DRUGS: Selective Estrogen Recepor Modulators

ESTROGEN REPLACEMENT THERAPY The efficacy of SERMs on estrogen receptor transcriptional activity was measured in a model of surgical menopause (ovx mice) SERMs ability to replace the natural hormone was evaluated by comparison with ER activity in healthy, cycling mice

Reproductive organs (mammari glands and vagina) Muscle-Skeletal System Hepatic area Measuring bioluminscence in the ERE-Luc reporter mouse Thymic area Intestine Bioluminescence after 6h treatment with 15 -estradiol (50ug/kg)

pellet days of treatment CONTROLS REFERENCE DRUG DRUG OF INTEREST Manual In vivo analysis of photon emission Automatic Rando et al. 2009

REPORTER MICE TO STUDY DRUG ACTION IN VIVO VAGINA CHEST Vehicle PCUD 3mg/kg BZA 10mg/kg BZA 10mg/kg + PCUD 3mg/kg Raloxifene 10mg/kg Luciferase enzymatic activityPhoton emission Biserni et al, in preparation

°** Vehicle PCUD 3mg/kg BZA 10mg/kg BZA 10mg/kg + PCUD 3mg/kg Raloxifene 10mg/kg Effects of SERMs on ER activity – in vivo imaging CHRONIC treatment (21 days) Biserni et al, in preparation

Effects of SERMs on ER activity – in vivo imaging CHRONIC treatment (21 days) Vehicle PCUD 3mg/kg BZA 10mg/kg BZA 10mg/kg + PCUD 3mg/kg Raloxifene 10mg/kg Biserni et al, in preparation

LIMB TAIL ACUTE CHRONIC Rando et al, Mol. Endocrinol. 2010

HEPATIC AREAABDOMEN ACUTE CHRONIC Rando et al, Mol. Endocrinol. 2010

SERCHING FOR NOVEL MODALITIES TO MEASURE THE EFFICACY OF SERMs AUC N° peaks, amplitude, frequency

Peaks/21d Period (d) GENITAL AREASKELETAL AREA * * * * * * * * * * Amplitude * * * * * * * * * * * * D A B C E AUC Potency Rando et al, Mol. Endocrinol. 2010

PHENETICS OF DRUG ACTION THE APPLICATION OF AGGLOMERATIVE HIERARCHICAL CLUSTERING (AGGLOMERATIVE NESTING version 1.02 )

a b DEGREE OF FUNCTIONAL CORRELATION AMONG THE PARAMETERS SELECTED Rando et al, Mol. Endocrinol. 2010

Space-temporal analysis of drug action in living animals clustering data to generate novel families of compounds Genital area Skeletal area Rando et al, Mol. Endocrinol. 2010

Genital area Skeletal area Reverse Medicinal Chemistry A B C Cl Rando et al, Mol. Endocrinol. 2010

…IL MEDICO ADOPRERA BENE LE MEDICINE QUANDO LUI CONOSCERA CHE COSA E OMO, CHE COSA E VITA E COMPLESSIONE, CHE COSA E SANITA…

ERE-Luc mouse P dpc (day post conception)post-natal day 1 endoderm mesoderm ectoderm imaging IHC A B CD E F G H C – intestine 20x D – bone 40x E – heart 40x F – forebrain 10x G – moustache 40x H – skin 20x 16.5 dpc GP Rando, 2007

ERE-Luc mouse ER is transcriptionally active at day 14.5 pc dpc (day post conception)

Suckling Mice Pregnancy & Embryo Development DAY 18.5 DAY 16.5 DAY 13.5 DAY 14.5 DAY 15.5 DAY 1 DAY 10 Immature Mice Adult Mice LIFE CYCLE ERE-Luc mice to understand ER involvement in mammals physiopathology

The whole is more than the sum of its parts Aristotle (384 BC – 322 BC) Methapysics The real impact of molecular engineering on drug discovery MODERN PHARMACOLOGY NEEDS TO REVISIT ANIMAL MODELS

FARMACI BIOTECNOLOGICI PROTEINE TERAPEUTICHE DI PRIMA E SECONDA GENERAZIONE ACIDI NUCLEICI per la regolazione della espressione di specifici geni

VANTAGGI NELLUTILIZZO DI FARMACI ANTI-ACIDI NUCLEICI BERSAGLIO MOLECOLARE PIU DEFINITO Numero di proteine intracellulari: Numero di RNA: Numero di geni: 1-2 AZIONE MOLTO SPECIFICA Bersagli possono essere sequenze anche uniche nel genoma Utilizzando interazioni con altri nucleotidi si possono sfruttare i vantaggi della complementarità tra due catene secondo il modello di Watson e Crick

ESPRESSIONE GENICA IN EUCARIOTE: SEQUENZA DI EVENTI 3 TRASCRIZIONE MODIFICAZ. TP TRADUZIONE RNA, trascritto primario Capping e poliadenilazione Splicing o maturazione Fuoriuscita dal nucleo riconoscimento da parte dei ribosomi traduzione Modificazioni post-traduzionali

La rilevanza dei processi di regolazione della espressione genica nel disegno di nuovi farmaci Lomeostasi cellulare è mantenuta da un efficiente controllo della trascrizione genica che viene assicurato da un complesso circuito molecolare che utilizza fattori di trascrizione individali, lapparato basale di trascrizione e i complessi multiproteici coregolatori della trascrizione.

La cromatina ha un ruolo fondamentale nella reglazione della espressione genica e la capacità degli istoni di legare il DNA è regolata da enzimi intranucleari che possono apportare modificazioni post- traduzionali soprattutto ai residui di lisina e arginina posti nel dominio N-terminale delle proteine istoniche Modificazioni degli istoni: acetilazione, fosforilazione, metilazione, ubiquitinazione

MODIFICAZIONI POST-TRADUZIONALI DEGLI ISTONI Zhang Y, Reinberg D Genes Dev. 2001;15:

La metilazione degli istoni aumenta lo stato di idrofobicità e la basicità delle porzioni N terminali degli istoni: questo ne aumenta laffinità per proteine specifiche e fattori di trascrizione. Le metilasi necessitano di cofattori: es. la s- adenosilmetionina Generalmente la metilazione degli istoni si associa a repressione della espressione genica, tuttavia ci sono esempi in cui la metilazione si associa a attivazione della espressione genica (metilazione lella lisina 4 dellistone 3, il coattivatore CARM1 è una metiltransferasi) Metilazione degli istoni

PROCESSI DI ACETILAZIONE E DEACETILAZIONE SONO IMPORTANTI NELLA REGOLAZIONE DELLA ATTIVITA DELLA CROMATINA ESPRESSIONE GENICA E GENERALMENTE ASSOCIATA CON ACETILAZIONE