Il clonaggio di un frammento di DNA richiede varie fasi Scelta e preparazione del vettore Preparazione dei frammenti di DNA da clonare Giunzione del DNA da clonare al vettore Introduzione nella cellula ospite Selezione Analisi dei prodotti

1200 bp SacI EcoRI

Isolamento acidi nucleici lisi cellulare deproteinizzazione concentrazione

Purificazione acidi nucleici Deproteinizzazione: agenti enzimatici solventi organici Precipitazione: cationi + etanolo (Na, NH4) isopropanolo

Purificazione acidi nucleici

Purificazione acidi nucleici

Isolamento DNA plasmidico Protocollo “artigianale” Colonnine cromatografiche (kit commerciali)

Protocollo artigianale Risospensione delle cellule in tampone con RNasi Lisi cellulare con NaOH/SDS Neutralizzazione con Kacetato (precipitazione di proteine) Estrazione fenolo/cloroformio Precipitazione con isopropanolo Risospensione in TE

Analisi acidi nucleici Spettrofotometro (quantitativa) Elettroforesi su gel (qualitativa, semiquantitativa)

1 OD260=50g/ml Spettro di assorbimento del DNA Assorbanza (OD) 220 240 260 280 300 320 0.5 1.0 1.5 lunghezza d’onda (nm) Assorbanza (OD) 1 OD260=50g/ml OD260/OD280=1,8-2,0

Elettroforesi di acidi nucleici Gel di agarosio Gel di acrilammide

PREPARAZIONE GEL DI AGAROSIO

GEL DI AGAROSIO

Elettroforesi su gel di agarosio

Lewin, IL GENE VIII, Zanichelli editore S.p.A. Copyright © 2006

CARICAMENTO GEL DI AGAROSIO

CARICAMENTO GEL DI AGAROSIO

CARICAMENTO GEL DI AGAROSIO

GEL DI AGAROSIO

al logaritmo in base 10 del numero di paia di basi. Migrazione del DNA su gel Le molecole lineari di dsDNA migrano a velocità inversamente proporzionali al logaritmo in base 10 del numero di paia di basi.

Fattori che influenzano la migrazione Peso molecolare Concentrazione di agarosio Conformazione DNA Voltaggio applicato Intercalanti Tampone di elettroforesi

Visualizzazione del DNA

Marcatori di peso molecolare  HindIII

DNA superavvolto negativamente DNA circolare con superavvolgimento = 0

B. LEWIN, IL GENE - Edizione compatta, Zanichelli Editore S. p. A B. LEWIN, IL GENE - Edizione compatta, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright © 2007

Tecniche di trasferimento su membrana (Blotting) Southern (blot) Northern (blot) Western (blot)

Metodi di trasferimento Capillare Elettroblot

Assemblaggio del blot capillare vaschetta carta 3MM carta 3MM } membrana nylon gel supporto tampone

Fattori che influenzano l’ibridazione Temperatura Forza ionica pH

ESERCITAZIONI DI BIOLOGIA MOLECOLARE AA 2008/2009 Descrizione generale esercitazioni di laboratorio Analisi del risultato di un clonaggio mediante elettroforesi su gel di agarosio: 1) Preparazione di DNA plasmidico dalle colonie trasformate 2) Analisi del DNA plasmidico su gel di agarosio Preparazione soluzione per la digestione con enzimi di restrizione 3) Digestione DNA plasmidico con enzimi di restrizione Analisi spettrofotometrica del DNA preparato 4) Analisi della digestione su gel di agarosio Discussione dei risultati

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