GASCROMATOGRAFIA (GC) L.S. in Scienze e tecnologie alimentari Anno Accademico 2008/2009 Corso integrato: Controllo delle modificazioni chimiche negli alimenti (7 CFU) Modulo: Chimica analitica strumentale (4 CFU) Giorgio Bonaga GASCROMATOGRAFIA (GC) (CAS-3a) Giorgio Bonaga

GASCROMATOGRAFIA (GC) fase mobile: gas I composti da separare (liquidi, solidi, gas) devono essere gas o resi gassosi. Lo stato di gas si ottiene riscaldando le sostanze nel momento dell’introduzione nello strumento e mantenendo il sistema a temperatura elevata (solo la temperatura della colonna può essere programmata con gradiente termico). CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE GAS-LIQUIDO (GLC) fase stazionaria: liquido su solido inerte o sulle pareti della colonna CROMATOGRAFIA DI ADSORBIMENTO GAS-SOLIDO (GSC) fase stazionaria: solido adsorbente CROMATOGRAFIA A FLUIDO SUPERCRITICO (SFC) fase stazionaria: fluido supercritico Giorgio Bonaga

iniettore del campione (injector); Le soluzioni di campione vengono iniettate in un sistema la cui pressione interna non è molto diversa dalla pressione atmosferica. Nella GC la fase mobile è un gas che non compete con la fase stazionaria, ma che ha semplicemente il compito di “trasportare” (carrier gas) i soluti all’estremità della colonna. La migrazione differenziale di soluti diversi è dovuta alle diverse interazioni soluto/fase stazionaria, ovvero alle diverse costanti di equilibrio termodinamico Kd di soluti differenti. Lo strumento della gascromatografia è il gascromatografo (Martin e Synge, 1941), le cui parti essenziali sono: bombola del gas inerte con riduttore di pressione a due stadi, regolatore del flusso di gas, rotametro (misuratore del flusso in entrata), separatore di flusso, flussimetro (misuratore del flusso in uscita); iniettore del campione (injector); colonna cromatografica alloggiata nel fornetto (oven) dello strumento; rivelatore (detector). Giorgio Bonaga 3

GASCROMATOGRAFO colonna OVEN B flussimetro detector injector Giorgio Bonaga GASCROMATOGRAFO flussimetro detector injector separatore del flusso Carrier gas: He, Ar, N2, H2, CO2 rotametro riduttore regolatore del flusso colonna colonna OVEN B 4

CROMATOGRAFIA DI RIPARTIZIONE GAS-LIQUIDO (GLC o GC) È ancora oggi la cromatografia più importante perché è quella che consente il maggior numero di applicazioni, specialmente nel settore dell’analisi degli alimenti, con una facile ottimizzazione delle condizioni operative. La separazione dei soluti è dovuta alla loro migrazione differenziale lungo la colonna per effetto delle differenti interazioni con la fase stazionaria (un liquido immobilizzato su un supporto solido inerte o sulle pareti della colonna). La fase mobile è solo un trasportatore (“carrier gas”), essa non partecipa al processo di ripartizione. Ogni fase stazionaria liquida ha caratteristiche chimico-fisiche proprie, tra le quali la pressione (o tensione) di vapore. Nella GC, tenendo conto che la fase mobile non partecipa alla partizione, l’unico parametro che può modificare l’equilibrio (ovvero la costante termodinamica Kd che lo descrive) è la temperatura. Un incremento di temperatura aumenta in modo esponenziale la tensione (pressione) di vapore degli analiti e di conseguenza un loro più rapido passaggio nella fase mobile. L’effetto finale è la riduzione del loro tempo di ritenzione (un incremento di circa 30°C produce il dimezzamento del tR). Giorgio Bonaga 5

PRESSIONE DI VAPORE Pvapore Tensione di vapore All’equilibrio è costante il rapporto tra il numero di molecole che dallo stato liquido passano alla stato gassoso e il numero di molecole che dallo stato gassoso passano allo stato liquido Giorgio Bonaga

PRESSIONE DI VAPORE (mm/Hg) RELAZIONE TEMPERATURA/ENERGIA CINETICA t1 t2 frazione di molecole Ecmedia (t1) Ecmedia (t2) Ec > forze intermolecolari del liquido liquido PRESSIONE DI VAPORE (mm/Hg) 0°C 20°C 30°C etere etilico 185 442 647 etanolo 12 44 74 acqua 5 18 32 Giorgio Bonaga

RELAZIONE TEMPERATURA/PRESSIONE DI VAPORE 48,0 24,0 12,0 6,0 3,0 1,5 millibar Tensione di vapore -30 -20 -10 0 10 20 30 t (°C) Giorgio Bonaga

RELAZIONE TEMPERATURA/TEMPO DI RITENZIONE tR= 4’ t tR= 2’ t + 30°C Giorgio Bonaga

ALLARGAMENTO DEI PICCHI IN GC L’allargamento dei picchi è governato dall’altezza equivalente del piatto teorico (HETP), tenuto conto che alcuni termini dell’espressione vanno modificati sulla base delle specificità della GC: Dgas Dm dp2 W dc2 v Q U dliq2 v HETP = 2 dp. l + + + 2 g v Dm Dgas Ds Dliq Inglobando tutte le costanti caratteristiche di una determinata colonna e di una determinata fase stazionaria (dp, l, g, dc, Q, U, dliq, Dliq) ed anche di un determinato gas (Dgas) nelle costanti A, B e C, l’equazione può essere scritta nella versione di Van Deemter, che correla queste costanti alla velocità lineare media di flusso del gas di trasporto (v): HETP = A + B + C . v Verranno discussi più avanti i profili di questa equazione in relazione al tipo di colonna GC utilizzata. v Giorgio Bonaga 10

LE VARIABILI DELLA GC Nell’analisi gascromatografica, analogamente alle altre tecniche analitiche, si deve operare una scelta delle variabili del sistema, sulla base delle caratteristiche della miscela che bisogna analizzare. Nella gascromatografia di ripartizione le variabili sono: TIPO DI COLONNA (impaccata o capillare) FASE STAZIONARIA (supporto solido inerte e liquido di partizione) FASE MOBILE (tipo di gas e velocità di flusso) TEMPERATURA (isoterma o programmata) INIETTORE (on column, split/splitless) RIVELATORE (FID, TCD, ECD, NPD) Gli argomenti verranno trattati in riferimento alla gascromatografia tradizionale, perchè gli ultimi sviluppi di questa tecnica (“Fast GC”, “Ultra Fast GC” e “2DGC”) verranno illustrati separatamente. Giorgio Bonaga 11

1. TIPO DI COLONNA La classificazione fondamentale delle colonne per GC è: 1. COLONNE IMPACCATE (“Packed Colum”): sono tubi di acciaio inossidabile, rame o vetro che vengono riempiti con una fase stazionaria costituita da a) supporto solido (di diversa composizione e granulometria, opportunamente trattato) sul quale si deposita b) film del liquido di partizione (liquido alle temperature di esercizio). 2. COLONNE CAPILLARI (“Open Tubular”): sono tubi di vetro o di silice fusa, con a) film di liquido di partizione supportato su b1) parete interna della colonna (WCOT = Wall Coated Open Tubular), b2) strato poroso sulla parete interna della colonna (SCOT = Support Coated Open Tubular), b3) parete interna della colonna resa porosa (PLOT = Porous Layer Open Tubular) 3. COLONNE MEGABORE (“Open Tubular”): la loro efficienza è intermedia tra quella delle impaccate e quella delle capillari. Hanno elevata capacità (quantità iniettabile fino a 3 ml) e compatibilità con tutti i tipi di iniettori GC. Giorgio Bonaga 12

colonne impaccate di vetro packed glass column colonne capillari di silice fusa capillary fused silica column Giorgio Bonaga 13

IMPACCATA WCOT SCOT PLOT vetro fase stazionaria (supporo+liquido) Giorgio Bonaga vetro fase stazionaria (supporo+liquido) IMPACCATA “Open Tubular” liquido di partizione silice strato poroso WCOT SCOT PLOT 14

0,25-0,53 mm (i.d.) 0,1-25 mm (f.t.) 3,0 mm (i.d.) GC-impaccata CARATTERISTICHE CAPILLARI MEGABORE IMPACCATE WCOT SCOT PLOT diametro interno (mm) 0,32-0,53 0,53 3-6 piatti teorici/m 1000-4000 600-1200 2000-4000 2000 500-1000 lunghezza massima (m) 150 10 3 piatti teorici totali (N) 3000000 150000 450000 20000 3000 fase liquida (%) - 5-10 spessore fase liquida (mm) 0,1-0,5 15-25 1-10 granulometria supporto (mesh) 80-120 flusso medio (ml/min) 0,5-5,0 0,3-4,0 20-70 velocità lineare media (cm/s) 20-50 50-100 10-40 10-50 0,25-0,53 mm (i.d.) 0,1-25 mm (f.t.) 3,0 mm (i.d.) GC-impaccata GC-capillare Giorgio Bonaga 15

PERCENTUALE DI CARICO E RAPPORTO b COLONNE IMPACCATE Il rapporto tra la massa del liquido di partizione e la massa totale della fase stazionaria (supporto solido + liquido di partizione) espresso in percentuale (ossia la concentrazione percentuale in peso) è la: % di carico = massa liquido di partizione massa fase stazionaria ESEMPIO Una colonna è stata impaccata con 1,5 g di liquido di partizione e 48,5 g di supporto solido, la percentuale di carico è 1,5/50 = 3% 2. COLONNE CAPILLARI Il rapporto tra il diametro interno della colonna capillare e lo spessore del liquido di partizione è espresso dall’equazione: rapporto b = i.d. = i.r. 4 f.t. 2 f.t. dove: i.d. = diametro interno della colonna (in mm) i.r. = raggio interno della colonna (= i.d./2) f.t. = film thickness (in mm) Giorgio Bonaga 16

rapporto b = i.d. = i.r. 4 f.t. 2 f.t. film thickness in mm (f.t.) diametro interno in mm (i.d.) rapporto b = i.d. = i.r. 4 f.t. 2 f.t. Giorgio Bonaga 17

per scegliere la colonna idonea alla soluzione di soluti da separare; Maggiore è il valore del rapporto b minore è la frazione di tempo che i soluti trascorrono nel liquido di partizione, ossia minori sono i loro tR. Il rapporto b è utile: per scegliere la colonna idonea alla soluzione di soluti da separare; per confrontare le separazioni fatte con colonne di differente diametro (se hanno lo stesso b, le separazioni risulteranno fondamentalmente uguali). ESEMPIO 0,32 mm i.d./7,0 mm f.t. 0,32 mm i.d./0,8 mm f.t. b mol wt soluti da separare 12-100 16-350 gas, solventi, idrocarburi a bassa massa molecolare, alogenati volatili 100-320 100-700 campo delle applicazioni più comuni 320-1325 350-1500 Idrocarburi ad alta massa molecolare, cere, prodotti petroliferi 0,53 mm i.d./0,1 mm f.t. 0,53 mm i.d./0,4 mm f.t. Giorgio Bonaga 18

EQUAZIONE DI VAN DEEMTER Il trasferimento dell’equazione di Van Deemter alle colonne GC deve tenere conto delle specificità delle colonne: 1. le colonne impaccate sono riempite con un supporto inerte ricoperto dal liquido di partizione. Rispetto l’HETP questo sistema mostra: un maggior effetto eddy per la tortuosità dei percorsi; una minore diffusione longitudinale per la resistenza offerta dalle particelle di fase stazionaria (fattore di ostruzione = 0,6); maggiori trasferimenti di massa nella fase mobile per effetto della maggior dimensione delle particelle di fase stazionaria; maggiore trasferimento di massa nella fase stazionaria e maggiore resistenza al trasferimento di massa tra le due fasi (elevato “loading”). 2. le colonne capillari sono “open tubular”, con film di liquido di partizione depositato sulle pareti della colonna o su strati porosi aderenti alle pareti della colonna. Rispetto l’HETP questo sistema mostra: la mancanza dell’effetto eddy; una maggiore diffusione longitudinale per la minore resistenza offerta dallo strato di fase stazionaria sulle pareti della colonna (fattore di ostruzione = 1,0); minore resistenza al trasferimento di massa tra il film del liquido di partizione e la fase mobile gassosa (basso “loading”). Giorgio Bonaga 19

Queste considerazioni spiegano il diverso andamento grafico delle equazioni di Van Deemter: COLONNE IMPACCATE COLONNE CAPILLARI HETP = A + B/v + C . v HETP = B/v + C . v HETP B / v C . v HETP B / v C . v A v v Giorgio Bonaga 20

2. FASE STAZIONARIA a) SUPPORTO INERTE PER COLONNE IMPACCATE Ha la funzione di garantire al liquido di partizione la maggior superficie di contatto con la fase mobile. Il supporto ideale è costituito da particelle sferiche uniformi, inerti, con buona resistenza meccanica, con un’area specifica di 1 m2/g. In realtà di impiegano materiali diversi: gel di silice (da terra di diatomee) allumina carbone e carbone grafitato setacci molecolari (zeoliti) polimeri e copolimeri organici solidi porosi (resine) Giorgio Bonaga gel di silice diatomee allumina carbone zeoliti resine 21

COMPOSIZIONE CHIMICA DI SUPPORTI A BASE DI SILICATI COMPONENTE Firebrick C22 Celite 545 Chromosorb P W SiO2 89,7 89,9 89,2 91,2 Al2O3 5,1 3,6 4,1 Fe2O3 1,6 1,7 1,5 1,1 TiO2 0,3 Cao 1,3 1,8 0,9 0,7 Mgo 1,0 COMPOSIZIONE CHIMICA DI SUPPORTI A BASE DI RESINE RESINA COMPOSIZIONE Porapak A etilvinilbenzene/divinilbenzene Porapak N polivinilpirrolidone Porapak P stirene/divinilbenzene Porapak T etilenglicoledimetacrilato Chromosorb T politetrafluoroetilene Giorgio Bonaga 22

Porapak A Porapak N Porapak P m n n n m etilvinilbenzene divinilbenzene polivinilpirrolidone stirene divinilbenzene Porapak A Porapak N Porapak P n n etilenglicoldimetacrilato politetrafluoroetilene Porapak T Chromosorb T Giorgio Bonaga 23

TRATTAMENTO DEL SUPPORTO Il materiale a base di silicati (scheletri di diatomee) viene sottoposto ad una procedura di ottimizzazione (la sua funzione infatti è di alloggiare il liquido di partizione, ma non produrre fenomeni di adsorbimento o di interazione con i soluti) che prevede i seguenti passaggi: inattivazione (trattamento con HCl a riflusso seguito da calcinazione per trasformare i “gruppi silanolici” in “gruppi silossanici” e per eliminare sostanze con elevata tensione di vapore); fusione con NaCO3 (per garantire una cottura che produca “mattonelle”); triturazione (per ottenere materiale polverulento); setacciamento (per selezionare il supporto in base alla granulometria) inerzializzazione (per convertire i gruppi silanolici residui nei corrispondenti derivati) Giorgio Bonaga 24

INATTIVAZIONE Il trattamento con HCl a riflusso trasforma i gruppi silanolici superficiali in gruppi silossanici, mentre con la calcinazione si ottiene la rottura dei ponti silossanici preesistenti con un aumento della porosità del supporto. La superficie porosa del supporto consente una migliore adesione del liquido di partizione. Sono le condizioni del trattamento idrotermico (concentrazione di HCl e temperatura della calcinazione), unitamente alla composizione chimica del silicato, che determinano le proprietà dei supporti (densità libera, densità impaccata, area superficiale, pH). gruppo silanolico HCl T (°C) poro gruppo silossanico Giorgio Bonaga 25

SETACCIAMENTO Si impiegano dei setacci con un diverso numero di maglie per unità di superficie: l’unità di misura è il mesh = numero di maglie/inch2 ( 1 pollice = 2,54 cm). L’indicazione 60-80 mesh caratterizza quelle particelle che passano attraverso le maglie del setaccio a 60 mesh, ma vengono trattenute dal setaccio a 80 mesh. E così via. 60 mesh 80mesh 100 mesh 80 mesh ~ 170-250 mm ~ 150-170 mm Giorgio Bonaga 26

.. INERZIALIZZAZIONE (FUNZIONALIZZAZIONE) Consiste nella silanizzazione dei gruppi silanolici (-Si-OH) residui con agenti sililanti, ovvero in grado di trasformare gli –OH liberi dei gruppi silanolici nei corrispondenti trimetilsilil-derivati (-OTMS). trimetilclorosilano esametildisilazano (TMCS) (HMDSA) .. + + HCl sito attivo verso sito inerte i soluti (- OTMS) Giorgio Bonaga 27