L’importanza del controllo dell’espressione dei geni Geni “housekeeping”, che devono essere espressi in tutti i tipi cellulari sempre allo stesso livello (es. Fattori di trascrizione “generali” o GTFs, DNA e RNA polimerasi, actina, istoni….) Geni specializzati/tessuto-specifici/specifici di un certo stadio di sviluppo embrionale (es. Recettori di membrana, Immunoglobuline, enzimi specifici) Geni inducibili, tessuto-specifici o meno (es. Fattori di trascrizione, enzimi, mediatori dell’ infiammazione, ormoni)

Attivazione/inattivazione dell’espressione genica Procarioti: risposte cellulari all’ambiente esterno Eucarioti: Decisioni cellulari durante lo sviluppo -> differenziamento Regulazione del ciclo cellulare Attivazione cellulare -> in risposta a mediatori esterni quali fattori di crescita, ormoni etc. (reversibile, rapida)

La regolazione dell’espressione genica avviene a numerosi livelli: 9.2

Il controllo della trascrizione avviene a numerosi livelli: Pre-attivazione (Induzione di uno stato trascrizionalmente competente) Inizio/re-inizio della trascrizione Elongazione del trascritto Terminazione del trascritto Fattori di trascrizione legati a specifici promotori/enhancers Co-attivatori (acetilasi degli istoni, attivita’ che rimodellano la cromatina) Fattori “generali” di trascrizione (GTFs) e RNA polimerasi

Diversamente dai procarioti, la trascrizione dei geni eucarioti e’ controllata da numerosi elementi TATA Basal tr. machinery TBP TFIIs Pol.II PROMOTORE PROSSIMALE CORE ~ -200 ~ -50 ENHANCER (~ 100 bp) Perche’? LA CROMATINA

Il DNA nei cromosomi non e’ lineare fibra di 30 nm cromatina decondensata (collana di perle)

I nucleosomi sono costituiti da DNA avvolto attorno a un ottamero costituito da 2 copie degli istoni H2A, H2B, H3 e H4

I nucleosomi sono compattati insieme dall’istone H1 a formare la fibra da 30 nm (cromatina)

Il modello “a solenoide” della cromatina condensata (fibra da 30 nm)

Acetilazione degli istoni Gli istoni nel nucleosoma contengono code aminoterminali flessibili che sporgono dalla loro porzione globulare, ricche in lisine (aa con carica positiva) in virtu’ della carica positiva, le lisine interagiscono con i gruppi fosfato del DNA -> COMPATTAMENTO le lisine possono essere reversibilmente acetilate e deacetilate da enzimi specifici (HAT, HDAC) l’acetilazione neutralizza la carica positiva eliminando l’interazione con il DNA e rendendo meno facile la compattazione dei nucleosomi.

La cromatina viene ulteriormente compattata nel cromosoma metafasico

in particolare - acetilasi degli istoni La complessita’ del macchinario trascrizionale di un gene eucariote e’ in buona parte correlato alla natura repressoria della cromatina. Tale repressione deve essere rilasciata prima che la trascrizione possa avvenire. Cio’ avviene ad opera dei numerosi attivatori e co-attivatori coinvolti in particolare - acetilasi degli istoni - proteine che rimodellano/riposizionano i nucleosomi Basal tr. machinery TBP TFIIs Pol.II TATA ~ -50 ~ -200 PROSSIMALE CORE ENHANCER (~ 100 bp) PROMOTORE

Esempio di come i diversi elementi di controllo di un gene possono integrarsi a livello del promoter “core” 9.44 Looping/integration of factors on the promoter

L’inizio della trascrizione da parte dell’RNA Pol II richiede multipli fattori Fattori di trascrizione generali (GTF) insieme con l’RNA Pol II formano l’apparato trascrizionale basale, sufficiente alla trascrizione in vitro TBP (che con i fattori associati a TBP (TAF) forma -> TFIID) TFIIA, TFIIB, TFIIF, TFIIE, TFIIH Co-attivatori, che sono richiesti per la trascrizione in presenza di cromatina (trascrizione attivata) TAFs Acetilasi di istoni (HATs) Proteine che rimodellano la cromatina (SWI/SNF) Fattori di trascrizione specifici, anche richiesti per la trascrizione attivata: servono per reclutare e assemblare l’apparato trascrizionale Si legano a elementi di riconoscimento sul promotore e sull’enhancer Multipli fattori di trascrizione sono normalmente coinvolti nell’attivazione di un gene

Il promotore essenziale (core promoter) Determina il sito di inizio della trascrizione e dirige il legame dell’ RNA Pol II Il promotore essenziale più frequente per l’RNA Pol II è la TATA box: la sua sequenza e’ altamente conservata (TATAAA); si trova prevalentemente in geni che vengono trascritti rapidamente, ed e’ localizzata ~25-30 bp a monte del sito di inizio della trascrizione. la TATA box dirige l’inizio della trascrizione a siti ben definiti Isole CpG: proprio di molti geni “house-keeping”. La trascrizione comincia a siti multipli disseminati in una regione di circa 20-200-bp.

Il complesso trascrizionale dell’RNA polimerasi II viene assemblato a tappe successive (in vitro) TBP + TAFs=TFIID Lodish

co-attivatori Richiesti per la funzione dei fattori di trascrizione specifici (aumentano ~30x le risposte agli attivatori) NON richiesti per la trascrizione basale (ma la stimolano ~10x) NON legano specificamente il DNA

Co-attivatori: TAF Un modello per le funzioni associate a TFIID Naar, 2001, Ann. Rev. Biochem. 70, 475

La trascrizione dei geni eucarioti e’ controllata da diversi elementi TATA Basal tr. machinery TBP TFIIs Pol.II PROMOTORE PROSSIMALE CORE ~ -200 ~ -50 ENHANCER (~ 100 bp) La funzione principale dei fattori di trascrizione e’ di facilitare l’assemblaggio del macchinario basale di trascrizione sul promotore essenziale (core). Questo avviene - tramite reclutamento di GTF - tramite reclutamento di HAT oppure di attivita’ che rimodellano la cromatina - tramite attivita’ acetilasiche intrinsiche

I fattori trascrizionali sono proteine modulari

Struttura modulare dei fattori di trascrizione: il dominio di attivazione Una sequenza polipeptidica che attiva la trascrizione quando fusa con un motivo di legame al DNA Sono essenzialmente superfici adatte a mediare interazioni proteina-proteina attraverso le quali puo’ avvenire il reclutamento dei diversi componenti del macchinario trascrizionale (altri fattori di trascrizione, co-attivatori, GTFs, HAT, SWI/SNF) Spesso comprendono aa acidici

Il dominio di attivazione favorisce l’assemblamento del macchinario trascrizionale

10.7 Activators stimulate the highly cooperative assembly of initiation complexes Binding sites for activators that control transcription of the mouse TTR gene Lodish Figure 10-60

10.7 Model for cooperative assembly of an activated transcription-initiation complex in the TTR promoter Lodish Figure 10-61

I repressori trascrizionali sono spesso l’inverso funzionale degli attivatori

Esempio di reclutamento di de-acetilasi o acetilasi degli istoni da parte di attivatori/repressori della trascrizione

Concetti addizionali: come controllare gli attivatori? Espressione tessuto-specifica o inducibile di fattori di trascrizione costitutivamente attivi Attivazione post-traduzionale di fattori inattivi (es. tramite fosforilazione) Regolazione della localizzazione cellulare (e.s sequestramento nel citoplasma) Attivazione mediata da ligando (es. ormoni steroidei)