IL MISTERO DELLA GIOVANE DONNA MORTA D’INFARTO Gruppo Biologia Molecolare 2009-2010
Autopsia: Giovane donna morta (30 anni circa). Non presenta lesioni corporee. Nelle coronarie presenta trombosi che le ha procurato un infarto fulminante: necrosi del tessuto cardiaco muscolare.
Discussione del Caso: Fattori: - Obesità - Fumo - Depressione post-parto - Assunzione di sonniferi - Morte sospetta della bisnonna
Il fattore V di Leiden:
Estrazione del DNA dal sangue: Separazione dei globuli bianchi dal resto del sangue. Rottura membrana cellulare (nucleare) tramite l’enzima proteasi. Aggiunta dell’Etanolo assoluto (anfipatico) Centrifugare e inserire i tamponi AW1 eAW2 Aggiunta H2O deionizzata
Amplificazione del DNA: la PCR Perché amplifichiamo il DNA? Il DNA estratto nel passo precedente viene inserito in una soluzione contenente: - Mastermix (primers e nucleotidi) - Taq polimerasi (polimerizzazione) Il programma di amplificazione del DNA: - 94°C (denaturazione) - 60°C (annealing dei primers) -72°C (polimerizzazione)
Cicli PCR:
Digestione con enzimi di restrizione e separazione elettroforetica: Dopo la polimerizzazione del DNA viene aggiunto l’enzima di restrizione. Scopo: tagliare i vari filamenti di DNA nei punti “specifici”. Il gene sano verrebbe tagliato in due punti specifici. Quando il paziente è affetto dal fattore V Leiden l’enzima di restrizione taglia solo in un punto il gene Una base azotata è mutata
Analisi elettroforetica: Perché eseguire l’analisi elettroforetica? Separare i pezzi del gene Il DNA, essendo carico negativamente, migra verso il polo positivo. Gel Agarosio: “rete” che ostacola i filamenti di DNA: Filamenti corti arrivano più vicino al polo + Filamenti lunghi si fermeranno più lontano al polo + rispetto ai filamenti corti
Possibili errori avvenuti durante l’analisi: Taq-Polimerasi Primers Errore durante l’estrazione del DNA
Conclusioni: Donna affetta dal fattore V Leiden Genitori saranno entrambi eterozigoti La figlia sarà sicuramente etrozigote, oppure addiruttura omozigote