I tannini sono composti fenolici presenti in diverse piante di interesse alimentare, abbondanti nel tè, nel caffè, nel cacao, nel vino, nei mirtilli,

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3 I tannini sono composti fenolici presenti in diverse piante di interesse alimentare, abbondanti nel tè, nel caffè, nel cacao, nel vino, nei mirtilli, ecc…sono meno rappresentati nei cereali. I tannini possono interferire negativamente con l’assunzione di alcuni nutrienti presenti in tali bevande o alimenti, potendo legare proteine e polisaccaridi e chelare metalli. TANNINI

4 Affinché avvenga l'interazione tannini-proteine, è necessario che i tannini presentino una struttura adeguata con un elevato peso molecolare. Le dimensioni ottimali sono comprese tra 1.000-3.000 Dalton (un polimero di 3-10 unità monomeriche). Tali dimensioni di polimero sono sufficientemente grandi per creare un legame incrociato con la catena del collagene, ma sono anche altresì piccole per penetrare nella regione interfibrillare e raggiungere i siti attivi. Oggi si utilizza genericamente il termine tannino per indicare i polimeri dei composti fenolici vegetali che presentano determinate caratteristiche chimico-fisiche quali 1.solubilità in acqua 2. peso molecolare compreso tra 500 e 3000 3. capacità di interagire con le proteine e le poliammidi. Si parla di tannino nativo riferendosi a quello dell'uva e di tannino neoformato in riferimento a quello del vino. I tannini si distinguono dagli antociani per avere l'eterociclo ossigenato saturo. TANNINI

5 In soluzione i tannini possono interagire con le proteine e coprecipitano. Il legame avviene tra il gruppo degli idrossili fenolici dei polimeri tannici e l'ossigeno del gruppo cheto- imide (-CO-NH-) nella catena proteica. INTERAZIONE TANNINI-PROTEINE

6 TANNINI CONDENSATI

7 I tannini condensati si dividono in più classi in funzione dei gruppi ossidrili nella loro struttura di base 1.Quelli presenti nella buccia sono le prodelfinidine, costituite da unità di gallocatechine, 2. le procianidine derivate dalle catechine; alcune molecole sono legate all'acido gallico (AcG).  I tannini condensati più comuni sono polimeri del 3-flavanolo (gruppo delle catechine e dei loro epiisomeri), mentre meno diffusi sono i 3,4- flavandioli (gruppo della leucocianidina). Vengono denominate anche procianidine o leucocianidine perché possono dissociarsi se sottoposte a determinate condizioni termiche ed acide, per ossidazione possono trasformarsi in cianidine. TANNINI CONDENSATI

8 TANNINI IDROLIZZABILI NB. La classificazione dei tannini, in idrolizzatili e condensati, ha solamente un significato storico. Entrambi i gruppi, infatti, possono essere idrolizzati. Pertanto, questi termini vengono utilizzati soprattutto per differenziare i principali monomeri che compongono i polimeri, ossia l'acido gallo-ellagico glucosidato nei «tannini idrolizzabili» e i flavani nei «tannini condensati».

9  I fenoli polimerizzati contenuti nel vino di sgrondo bianco sono meno dell'1% dei fenoli totali, la cui concentrazione si aggira intorno ai 100-400 mg/l. Se il contatto con le bucce è stato mantenuto per diversi giorni, il contenuto può aumentare dal 2-5% sino al 10-20% sul totale.  Nel mosto di sgrondo di uva rossa, la percentuale dei fenoli polimerizzati varia dal 5 al 15% (sul totale dei fenoli), e può aumentare sino al 20-40% dovuto al prolungato contatto con le bucce.  Nei vini rossi invecchiati, tale percentuale è in costante aumento. I raspi e le foglie ne contengono quantità significative, rispettivamente circa 10.000 e 6.000 mg/kg. Tuttavia, durante una regolare vinificazione, il loro contributo alla concentrazione totale dei fenoli dovuta al contatto è piuttosto irrilevante. PRESENZA DEI TANNINI NEL VINO

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16 Le procianidine si trovano sia nella buccia che nei vinaccioli, ma in percentuali diverse e con grado di polimerizzazione differente. A differenza della polpa, nei semi i flavonoli si trovano in gran parte sotto forma di monomeri (catechina ed epicatechina) in genere esterificati con acido gallico.

17  I tannini dei vinaccioli sono procianidine parzialmente legate all'acido gallico (galloilazione). Costituite da unità monomeriche di catechina ed epicatechina, ed epicatechina esterificata con acido gallico; legate tra di loro attraverso legami C4-C6 oppure C4-C8.

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19 La polimerizzazione è più elevata nelle bucce. Nei vinaccioli c'è una maggior percentuale di oligomeri. Le proantocianidine dell'uva sono rappresentate da: nel vinacciolo i polimeri raggiungono le 20 unità nella buccia i polimeri possono raggiungere le 80 unità e a questi elevati valori risultano insolubili.

20 Tutti i composti fenolici all'interno delle cellule della buccia e nei semi si trovano separati; in seguito alla pigiatura fuoriescono dalle cellule della buccia e dei vinaccioli non in modo indiscriminato, ma in funzione del "grado di sostituzione" che conferisce loro anche una differente reattività. In questa fase ogni molecola va considerata come un prodotto intermedio; quindi la composizione del mosto e del vino cambia notevolmente a seconda delle combinazioni che si raggiungono nelle differenti condizioni. Quando il C4 è legato, come nel caso di un dimero, ci sono 5 carboni asimmetrici (). Questo aspetto permette un notevolissimo numero di combinazioni.

21 I tannini dei vinaccioli agiscono più o meno velocemente di quelli delle bucce? In realtà per motivi cinetici sono più reattivi i tannini dei semi perché il loro peso molecolare medio è più basso. E' appurato che le prodelfinidine e le procianidine delle bucce diffondono nel mosto più rapidamente delle procianidine dei semi. Visto che la reattività di tali molecole è lenta e diverse reazioni entrano contemporaneamente in gioco, è difficile sapere con certezza dove sta andando la reazione chimica. Tannini e antociani possono polimerizzare tra di loro formando molecole che hanno caratteristiche colloidali e che interagiscono con proteine e polisaccaridi. La loro influenza prioritaria è sul colore ma anche sul gusto.

22 Polifenoli  Dopo i carboidrati e gli acidi, i polifenoli o composti fenolici sono il gruppo più abbondante di costituenti chimici dell’uva. Nel vino hanno un ruolo importantissimo: innanzitutto sono responsabili delle differenze tra vini bianchi e vini rossi, soprattutto per colore e aroma, in particolare contribuendo al gusto amaro e all’astringenza del vino; in secondo luogo, hanno proprietà antiossidanti e battericide, particolarmente gradite dal punto di vista salutistico; infine hanno un ruolo primario nella conservazione e nell’invecchiamento del vino  A livello macroscopico, i polifenoli rappresentano la parte colorata e colorante del vino. Sono composti contenuti nella buccia dell'uva e la loro presenza nel vino dipende dalla tecnica di vinificazione. Il contatto più o meno prolungato del mosto con le bucce ne determina il contenuto nel mosto e quindi nel vino. In base al contenuto di polifenoli si possono classificare i vini come bianchi, rosati, rossi, rossissimi e torchiati. I vini bianchi hanno un contenuto in polifenoli inferiore rispetto ai vini rossi

23 Benefici dei polifenoli In campo enologico ed igienico-sanitario è ormai largamente condivisa la teoria che il vino abbia una notevole azione cardioprotettiva.  Studi epidemiologici e prove sperimentali condotte sull'uomo hanno dimostrato che il vino rosso riduce l'incidenza dell'arteriosclerosi coronarica più di ogni altra bevanda alcolica.  Successive indagini hanno altresì provato che i polifenoli hanno una potente azione antiossidante capace di inibire la formazione di lipoproteine ossidate (LDL) nell'uomo. Gli studiosi sembrano unanimemente concordi nell'attribuire tale importante azione terapeutica ai polifenoli e principalmente al Resveratrolo, composto contenuto nella buccia dell'uva e che induce nella bacca un tipo di resistenza ad infezioni da funghi

24 Paradosso francese Il termine French paradox (Paradosso francese) è stato coniato nel 1991 a proposito del fatto che, nella popolazione francese, l'incidenza di infarto del miocardio è circa la metà rispetto agli Stati Uniti e al Nordeuropa, nonostante la dieta del Francesi sia basata su un consumo di burro ed altri grassi animali altrettanto elevato Ormai è acclarato che la spiegazione consiste nell'abitudine diffusa ad un moderato consumo di vino rosso, alimento ricco di sostanze antiossidanti come sono i polifenoli

25 Attività antiossidante Ormai è acclarato che la spiegazione consiste nell'abitudine diffusa ad un moderato consumo di vino rosso, alimento ricco di sostanze antiossidanti come sono i polifenoli Per chiarire la potenzialità dei polifenoli in termini di salute, valutiamo l’attività antiossidante dei vini rossi in confronto con il loro contenuto di polifenoli totali e di antociani. Nell’analisi di 19 vini rossi del Trentino, si nota una correlazione strettissima tra i parametri considerati

26 Chimicamente i polifenoli si distinguono per la presenza di due o più gruppi fenolici, e sono suddivisibili nelle seguenti famiglie: Classificazione dei polifenoli 1. Flavonoidi, sostanze pigmentate con struttura caratteristica costituita da due gruppi benzenici uniti da un eterociclo con un atomo di ossigeno 2. Acidi fenolici, come gli acidi benzoici e gli acidi cinnamici 3. derivati degli acidi fenolici, come gli stilbeni tra cui il resveratrolo

27 Nella vinificazione in bianco, essendo scarso l’utilizzo delle bucce degli acini, passano nel vino principalmente i polifenoli contenuti nella polpa, che sono prevalentemente di tipo non flavonoide. Prevalgono gli acidi idrossibenzoici (acido gallico, vanillico, siringico, salicilico, gentisico), gli acidi idrossicinnamici (acido cumarico, caffeico, ferulico) e i loro esteri con l’acido tartarico (acido coutarico, caftarico, fertarico) che sono i polifenoli maggiori nei vini bianchi Polifenoli nei vini bianchi Acido gallico Acido caffeicoAcido caftarico o trans-caffeoiltartarico Catechina Oltre ai non flavonoidi, sono presenti polifenoli a struttura flavonoide chiamati flavan-3-oli, tra cui prevalgono la catechina e l’epicatechina, composti che contribuiscono significaticamente al profilo sensoriale. Derivati delle catechine sono le procianidine e gli esteri con l’acido gallico Procianidina

28 Nella vinificazione in rosso sono presenti tutti i polifenoli citati più altre famiglie di composti flavonoidi che sono contenuti in prevalenza nelle bucce. Essi sono: Polifenoli nei vini rossi Flavan-3,4-dioli o leucoantocianidine Flavonoli, composti che hanno quasi sempre un residuo di glucosio, tra cui la quercetina, la miricetina e il kaempferolo Antociani, i composti per eccellenza legati al colore del vino rosso Tannini, composti polimerici di origine anche non flavonoide e di grande importanza nelle caratteristiche organolettiche dei vini, in particolare di quelli invecchiati Flavan-3,4-diolo FlavonoloAntocianina

29 Come per gli zuccheri e per l’acidità, la determinazione dei polifenoli ha significato a livello dei singoli composti oppure sull’insieme dei composti della medesima famiglia Per quanto riguarda la determinazione totale dei composti fenolici, il metodo più noto è quello dell’Indice di Folin-Ciocalteau, nel quale si utilizza la spettrofotometria UV-visibile. Si utilizza il reattivo di Folin-Ciocalteau (miscela di acido fosfotungstico, H 3 PW 12 O 40, e acido fosfomolibdico, H 3 PMo 12 O 40 ) che in presenza di composti fenolici si riduce a miscela di ossidi di tungsteno e molibdeno (W 8 O 23 e Mo 8 O 23 ); la colorazione blu sviluppata ha un massimo di assorbimento a 750 nm. Convenzionalmente il risultato della misura spettrofotometrica si esprime in mg di acido gallico per litro di vino (GAE) Il metodo è molto pratico da eseguire, anche se ha scarsa selettività, in quanto misura il numero di gruppi fenolici presenti nel campione, quindi anche quelli dei monoidrossifenoli, ed è inoltre sensibile a sostanze facilmente ossidabili come l’acido ascorbico, l’anidride solforosa e gli zuccheri riducenti nei vini dolci Determinazione dei polifenoli

30 La determinazione dei singoli polifenoli è piuttosto complessa, in quanto non ci sono reazioni selettive che si possano sfruttare per effettuare ad esempio misure spettrofotometriche. La tecnica più idonea a determinare singolarmente i composti fenolici è la cromatografia, e in particolare, essendo i polifenoli composti non volatili, la tecnica HPLC Esistono metodi di separazione HPLC che consentono di determinare un quadro polifenolico abbastanza ampio, anche se mai esaustivo: abbiamo visto come sotto la denominazione polifenoli rientrino in realtà composti piuttosto diversi, che dal punto di vista cromatografico hanno comportamento sicuramente differente. Per cui la separazione cromatografica è possibile per alcuni dei più importanti composti fenolici, generalmente impiegando metodi in gradiente, che consentono nella stessa corsa cromatografica di modificare le caratteristiche della fase mobile in modo da includere nella separazione famiglie diverse di polifenoli In alternativa, esistono metodi di pretrattamento che consentono di isolare una o più famiglie di polifenoli che possono essere poi determinate con maggiore accuratezza Determinazione cromatografica

31 In questo esempio è riportato il cromatogramma di una miscela standard di polifenoli (A) separati su colonna C18 con una fase fissa acqua/metanolo/acido acetico in gradiente di metanolo. La rivelazione è spettrofotometrica a 280 nm Esempi di separazione di polifenoli A BC I polifenoli separati sono di tipo flavonoide e non flavonoide. Nel cromatogramma B è mostrata l’analisi di un vino rosso iniettato direttamente in colonna; il risultato migliora nettamente dopo estrazione liquido-liquido con dietiletere (C). Si noti il picco del resveratrolo (13)

32 Gli antociani Gli antociani sono composti polifenolici del gruppo dei flavonoidi. Essi vengono sintetizzati nelle bucce dell’uva, ai cui frutti impartiscono il colore che, a seconda degli antociani presenti, può essere verde-giallo, rosa, rosso, rosso-violetto, rosso-nero e blu- nero Nell’uva Vitis vinifera esistono cinque tipi di antocianine: Cianidina, Delfinidina, Malvidina, Peonidina e Petunidina Esistono poi alcuni derivati di questi cinque composti-base, in particolare gli esteri formati dal glucoside con l’acido acetico e p- cumarico

33 Gli antociani si trovano in strutture diverse a seconda del pH Equilibrio tra le forme

34 Determinazione degli antociani La determinazione del profilo antocianico è interessante dal punto di vista tassonomico, essendo questi composti tipici delle uve da cui deriva il vino e quindi teoricamente utili per riconoscere i vitigni impiegati. La separazione si effettua con tecnica HPLC su colonna C18 e fase mobile acqua/acetonitrile, normalmente in gradiente di solvente organico. La fase mobile ha pH acido (< 1.5) per avere le antocianine omogeneamente in forma di ione flavilio, il quale presenta un massimo di assorbimento a 520nm, in particolare a pH molto acido Questa separazione consente di determinare separatamente le 5 antocianine e i loro derivati esterei con gli acidi acetico, cumarico e caffeico

35 Il più importante tra i polifenoli è sicuramente il composto 3,5,4’- triidrossistilbene, più noto come trans-resveratrolo, appartente alla classe degli stilbeni. Questa sostanza, presente in molte piante ma in misura prevalente nell’uva, è diventata oggetto di numerosissime ricerche per le sue ormai accertate virtù medicamentose Il Resveratrolo L’origine di questo interesse sta nel fatto che la sua presenza è stata identificata in formulazioni erbali della tradizione popolare giapponese; attualmente, si ritiene che abbia proprietà antiinfiammatorie e anticoagulanti utili per la protezione dall’aterosclerosi e dalle malattie cardiovascolari In più, sembra che il resveratrolo possa inibire eventi cellulari associati all’insorgere e al procedere di tumori e ridurre la morte cellulare per stress ossidativi In definitiva, si tratta di uno dei composti più nobili presenti nel vino

36 Dal punto di vista biochimico, la sintesi del resveratrolo è causata in risposta a infezioni microbiche o stress nella vite, ma paradossalmente si produce anche per trattamenti chimici come l’applicazione di erbicidi e fungicidi, o per esposizione alla luce UV Nell’uva, la sintesi del resveratrolo è localizzata prevalentemente nelle cellule della buccia. Nella vinificazione in rosso, quindi, la macerazione con le bucce fa sì che i vini rossi abbiano livelli di resveratrolo maggiori rispetto ai vini bianchi Il contenuto di resveratrolo nel vino dipende soprattutto dalle caratteristiche genetiche del vitigno e dalle condizioni enologiche. Nei vini americani il livello di resveratrolo è inferiore a 1 mg/l, mentre nei vini europei la concentrazione è maggiore, soprattutto per quelli italiani, francesi e spagnoli. In alcuni casi è stato verificato l’effetto maggiorativo dell’esposizione solare della vite Il Resveratrolo nel vino

37 Determinazione del resveratrolo La determinazione quantitativa del resveratrolo nelle sue varie forme (isomeri liberi e glicosilati) si effettua mediante separazione cromatografica con la tecnica HPLC, utilizzando una fase fissa Si-C18 e una fase mobile costituita da un gradiente binario acqua/acetonitrile L’analisi non si effettua sul campione di vino tal quale, ma su un estratto ottenuto con SPE, facendo passare il campione su una fase adsorbente ed eluendo i composti trattenuti con tetraidrofurano Utilizzando il convenzionale rivelatore UV-visibile a 305 nm si ottiene il cromatogramma (a), mentre con l’impiego del rivelatore a spettrometria di massa (b) si ha un notevole incremento della sensibilità. Gli analiti separati sono: 1.trans-resveratrolo glicoside 2.cis-resveratrolo glicoside 3.trans-resveratrolo 4.cis-resveratrolo I.S.standard interno (acido 3,4,5-trimetossicinnamico)

38 Anidride solforosa L’anidride solforosa (SO 2 ) è un composto di grande importanza in enologia, in quanto, pur essendo utilizzata principalmente come antisettico, svolge anche altre funzioni: 1.asseconda l’estrazione delle sostanze coloranti, 2.protegge il mosto dall’ossidazione, 3. in generale, permette di ottenere vini più sani e serbevoli (cioè le cui caratteristiche possono conservarsi senza deterioramento per un certo periodo di tempo). 4.inoltre, forma composti di reazione con sostanze presenti nel vino, che in alcuni casi hanno influenza diretta sul gusto e sull’aroma; per questo si è soliti distinguere la percentuale di SO 2 libera e combinata. Composti che reagiscono facilmente sono gli antociani, l’acetaldeide e gli zuccheri In realtà, attualmente l’impiego della SO 2 è tendenzialmente limitato all’addizione in fase di svinatura e imbottigliamento; inoltre esistono precisi limiti di legge (160 mg/l per i vini rossi e 200 mg/l per i bianchi e i rosati) dovuti al fatto che si tratta di una sostanza che può dare disturbi intestinali o il famoso cerchio alla testa

39 Determinazione della SO 2 La determinazione della SO 2 si effettua per volumetria, utilizzando una titolazione acido-base oppure una titolazione redox Nel primo metodo, mediante una corrente di aria o di azoto la SO 2 viene fissata e ossidata per gorgogliamento in una soluzione diluita neutra di H 2 O 2 : SO 2 + H 2 O 2  SO 3 - + H 2 O  H 2 SO 4 L'acido solforico formato viene dosato con una soluzione a titolo noto di NaOH. Questo metodo determina la SO 2 totale; la frazione libera viene estratta dal vino per trascinamento a freddo (10ºC) Nel secondo metodo la SO 2 libera è dosata con titolazione iodometrica diretta: H 2 SO 3 + I 2  H 2 SO 4 + 2HI Si dosa quindi la SO 2 combinata dopo idrolisi alcalina e la SO 2 totale per somma delle due frazioni