La genetica forense è una delle numerose branche delle scienze forensi Nata all’inizio del 1900 ha acquisito oggi un ruolo molto importante Alcune tra.

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1 La genetica forense è una delle numerose branche delle scienze forensi Nata all’inizio del 1900 ha acquisito oggi un ruolo molto importante Alcune tra le sue principali applicazioni  Identificazione di autori di crimini, con contributi anche per  predire l’origine etnica di un individuo (es. Africano, Asiatico ecc.)  ottenere informazioni fenotipiche su un soggetto (es. colore occhi, capelli ecc.)  Attribuzione di paternità  Identificazione di cadaveri a identità ignota (soprattutto in disastri di massa)  Investigazioni storiche  Investigazioni su persone scomparse

2 L’importanza di questa branca della genetica è cresciuta enormemente negli anni grazie al miglioramento delle conoscenze sulla variabilità genetica della nostra specie e all’invenzione di tecniche estremamente sensibili attraverso le quali studiarla La genetica forense utilizza la diversità genetica esistente tra individui

3 Genetica forense e diversità genetica  quali regioni genomiche studiare?  quali marcatori? I marcatori più utilizzati in ambito forense sono i polimorfismi STR localizzati sugli autosomi una certa importanza è rivestita anche dai marcatori Y-specifici e dall’mtDNA

4 La Genetica Forense è nata con la genetica ed è cresciuta di pari passo con essa (scoperta di nuovi marcatori e messa a punto di nuove tecniche per esaminarli), la storia della Genetica Forense quindi ripercorre la storia dell’ampliarsi delle nostre conoscenze sulla variabilità genetica primo sistema polimorfico utilizzato in ambito forense: Sistema di gruppo sanguigno ABO (scoperto nel 1900 da Landsteiner) Ne viene chiarita la genetica verso il 1910 e subito utilizzato in ambito forense. Successivamente è stato affiancato da altri sistemi di gruppo sanguigno quali MN, Rh e altri fino ai circa 30 attualmente noti Caratteristiche : generalmente 2 soli alleli (tranne sistema ABO e pochi altri) quindi 3 fenotipi  possibilità di esclusione ma potere di attribuzione molto limitato rapidità di esecuzione, ma necessità di sangue relativamente fresco

5 Anni ‘60  si scopre che molte proteine eritrocitarie e sieriche presentano differenti forme alleliche Tali differenze venivano evidenziate mediante elettroforesi su vari supporti (quali amido, agar, agarosio, acrilammide ecc.) e successiva colorazione specifica No. di loci  20-30 Caratteristiche : generalmente solo 2 alleli quindi 3 fenotipi  possibilità di esclusione ma limitato potere di attribuzione; tecnica non rapidissima; la buona riuscita della tipizzazione dipende dallo stato di conservazione del materiale biologico I polimorfismi proteici

6 Anni ‘70  scoperta dei polimorfismi per la lunghezza dei frammenti di restrizione, RFLP. Venivano evidenziati con procedimenti lunghi e costosi e che necessitavano di grandi quantità di DNA Moltissimi loci  dell’ordine di 10 5 Scoperta degli RFLP Caratteristiche: generalmente solo 2 alleli quindi 3 fenotipi  possibilità di esclusione ma limitato potere di attribuzione per il singolo locus controbilanciato però dalla possibilità di studiare molti loci; impiego di una tecnica lunga e costosa e che necessita di grandi quantità di DNA (Southern blot); per la prima volta la variabilità genetica è studiata a livello di DNA (quindi su qualsiasi materiale biologico)

7 Sono una classe di DNA ripetuto in tandem, in cui il motivo ripetuto è di 8-100 bp e il numero di ripetizioni è spesso molto elevato (fino a 1000) Sono localizzati preferenzialmente nelle regioni subtelomeriche Il polimorfismo consiste nella presenza di un diverso numero di ripetizioni (= alleli diversi hanno lunghezza diversa) Il numero di alleli per locus è in genere nell’ordine delle decine (sistema multiallelico) Anni ‘80 la scoperta dei MINISATELLITI

8 Minisatelliti: il «DNA fingerprinting» Tecnica inventata da Jeffreys nel 1985, si basa sulla metodica del ‘southern blotting’ in cui si utilizza una sonda che riconosce un motivo ‘core’ comune a più minisatelliti in modo da evidenziare più loci minisatelliti contemporaneamente Il DNA fingerprinting 1.Estrazione del DNA 2.Digestione con enzimi di restrizione e separazione dei frammenti tramite elettroforesi 3.Denaturazione e trasferimento su membrana 4.Ibridazione con una sonda multi-locus marcata con radioattivo 5.Autoradiografia per rilevare i frammenti a cui si è legata la sonda Alec Jeffreys Si ottiene un pattern di bande complesso che, al pari delle impronte digitali, è specifico per ogni individuo

9 Inghilterra, anni ’80  primo caso criminale in cui si è usato il DNA fingerprinting, la tecnica è stata utilizzata nei due versi, cioè per scagionare un sospettato confermare la colpevolezza di un altro sospettato  1983: una ragazza viene violentata e uccisa (per strangolamento) nel Leicestershire (UK); utilizzando le tracce di liquido seminale si riescono a stabilire solo gruppo sanguigno AB0 e genotipo per la PGM1 che sono condivisi dal 10% degli abitanti maschi della zona  1986: una seconda ragazza viene violentata e uccisa nella stessa zona. modus operandi e dati genetici (AB0 e PGM1) sono gli stessi del precedente omicidio, si ipotizza quindi un unico colpevole  1986: un ragazzo con gruppo sanguigno A viene accusato dei due delitti, il ragazzo (con un ritardo mentale) viene spinto a confessare il secondo delitto, ma nega decisamente il primo

10 Inghilterra, anni ’80: primo caso criminale risolto mediante DNA typing (2)  viene utilizzata l’analisi del DNA mediante fingerprinting: si dimostra l’estraneità del ragazzo al primo delitto. Su richiesta del padre viene effettuato il confronto anche con il materiale biologico relativo al secondo delitto e si evidenzia l’estraneità del sospettato anche al secondo delitto  Viene organizzato uno screening di massa dei circa 5000 individui maschi tra i 17 e i 34 anni del Leicestershire. (1) determinazione del gruppo sanguigno AB0 e del genotipo per la PGM1: il numero dei potenziali colpevoli diminuisce a 500; (2) analisi mediante DNA fingerprinting  nessuno dei DNA prelevati presenta un fingerprinting corrispondente a quello dell’assassino  1987: per puro caso si scopre che un certo Colin Pitchfork aveva evitato il prelievo facendosi sostituire da un amico  Viene prelevato un campione di sangue di Pitchfork  il profilo del suo DNA risulta identico a quello del DNA raccolto sulla scena dei due delitti

11 Vantaggi e limiti:  Potere di discriminazione elevato  Sensibilità limitata (richiede grandi quantità di DNA   g, cioè ca. 10 6 cellule)  Tecnica lunga e non automatizzabile  Analizza DNA a elevato peso molecolare: non adatto per campioni degradati  Pattern multi-bande di non facile interpretazione (base molecolare del polimorfismo non nota)  Problemi per l’interpretazione statistica (una corrispondenza che valore statistico, e quindi probatorio, ha?) Minisatelliti: esempio di «DNA fingerprinting»

12 Il DNA fingerprinting in un caso di attribuzione di paternità (A) e in un caso di individuazione dell’autore di un crimine (B) Le frecce indicano bande presenti nel figlio ma non nella madre: devono essere presenti nel padre

13 La PCR permette di risolvere un problema ricorrente nelle indagini criminali: la scarsa quantità di DNA che è possibile ottenere da molti reperti Inizialmente la PCR viene utilizzata per l’amplificazione di un locus multiallelico del complesso MHC, successivamente per amplificare un locus minisatellite (D1S80) 1985  viene inventata la PCR 1990  il suo uso viene ammesso in ambito forense

14 Pochi anni dopo viene scoperta una classe di marcatori con caratteristiche pressoché ottimali per le indagini di genetica forense: I microsatelliti o STR (Short Tandem Repeat) Ripetizioni in tandem di brevi (2-5 bp) tratti nucleotidici (repeat) Il polimorfismo consiste nel diverso numero di copie della repeat (= alleli diversi hanno lunghezza diversa) Il numero degli alleli è generalmente elevato (talvolta molto elevato) Sono uniformemente distribuiti in tutto il genoma, nei primati rappresentano ca. l’1% del genoma La svolta: la scoperta dei microsatelliti

15 Esempio di microsatellite utilizzato in genetica forense: D16S539

16 I microsatelliti possono essere perfetti, interrotti o composti, sono classificati anche in base alla lunghezza del motivo ripetuto (dinucleotidici, trinucleotidici ecc..) perfetti interrotti composti Natura molecolare dei microsatelliti

17 Il microsatellite ‘ideale’ in genetica forense 1)elevata eterozigosità 2)amplificabile in corti prodotti di PCR 3)alleli ben separabili su gel 4)tasso di mutazione non particolarmente elevato 5)ridotto fenomeno di ‘stuttering’

18 Nomenclatura dei microsatelliti (e dei loro alleli) Necessità di fare riferimento ad una nomenclatura univoca per permettere il confronto tra laboratori e database diversi (1) Scelta del filamento -Se il microsatellite è in un gene, si considera il filamento codificante -Se il microsatellite non è in un gene, si fa riferimento al filamento originariamente descritto in letteratura La direzione di lettura è sempre 5’-3’ Gli alleli vengono indicati con la sequenza ripetuta scritta tra parentesi e un numero che indica il no. di volte in cui la repeat è presente Esempio: (TTCT) 12  allele di un STR tetranucleotidico in cui il motivo TTCT è ripetuto 12 volte

19 E’ possibile amplificare più loci contemporaneamente in un’unica reazione di PCR (PCR multiplex) STR  come li si studia Amplificazione del tratto comprendente la ripetizione utilizzando primer esterni alla ripetizione stessa Separazione dei prodotti di amplificazione su gel di acrilamide o tramite elettroforesi capillare  gli omozigoti presentano una sola banda (o un solo picco di fluorescenza), gli eterozigoti ne presentano due

20 Principio su cui si basa la PCR multiplex 1. Amplificazione simultanea di 3 loci con primer disegnati in modo tale da generare ampliconi di dimensioni diverse 2. Separazione dei prodotti di PCR (possibile vista la loro diversa dimensione) L’uso di fluorofori diversi aumenta il no. di loci che possono essere studiati in una singola reazione di PCR: la separazione degli ampliconi avviene sulla base delle dimensioni e/o della fluorescenza emessa

21 PCR multiplex 1a. Amplificazione di 3 loci (A, B e C) con primer disegnati in modo tale da generare ampliconi di dimensioni diverse (x, y e z). Le 3 coppie di primer sono marcate con lo stesso fluoroforo (ad es. VIC) 1b. Amplificazione di altri 3 loci (D, E e F) con primer disegnati in modo tale da generare ampliconi di dimensioni x, y e z. Le 3 coppie di primer sono marcate con un fluoroforo diverso dal precedente (es. FAM) Se le 6 coppie di primer hanno T annealing simili la reazione può avvenire in un’unica provetta Locus A x = 100-120 bp Locus B y = 150-170 bp Locus C z = 200-230 bp Locus D x = 100-120 bp Locus E y = 150-170 bp Locus F z = 200-230 bp

22 PCR multiplex I frammenti dei loci A, B e C sono di dimensioni diverse ed emettono la medesima fluorescenza (VIC) I frammenti dei loci D, E e F sono di dimensioni diverse ed emettono la medesima fluorescenza (FAM) I frammenti dei loci A e D sono della stessa dimensione (x) ma emettono fluorescenze diverse (VIC per l’A e FAM per il D) I frammenti dei loci B e E sono della stessa dimensione (y) ma emettono fluorescenze diverse (VIC per il B e FAM per l’E) I frammenti dei loci C e F sono della stessa dimensione (z) ma emettono fluorescenze diverse (VIC per il C e FAM per l’F) Locus A x = 100-120 bp Locus B y = 150-170 bp Locus C z = 200-230 bp Locus D x = 100-120 bp Locus E y = 150-170 bp Locus F z = 200-230 bp

23 PRESENZA DI INIBITORI: I reperti biologici possono essere mescolati con inibitori della PCR di tipo organico e inorganico CONTAMINAZIONE DA ALTRO DNA, tale contaminazione puo’ verificarsi sia in fase di repertazione che in laboratorio (più probabile in caso di DNA scarso e/o degradato)  Utilizzo di guanti e mascherine monouso (in repertazione e in lab)  In laboratorio utilizzo di tutte le precauzioni per evitare la contaminazione (separazione di spazi pre- e post-PCR, uso di puntali monouso con filtro, irradiazione con raggi UV dell’area dedicata alla preparazione della PCR, ecc.)  Creazione di un database dei profili genetici del personale del laboratorio e del personale che ha effettuato la repertazione Amplificazione mediante PCR: problemi in genetica forense investigativa

24 Workflow per generare un profilo di DNA: 1)(estrazione del DNA con metodi che variano a seconda del tipo di campione biologico) 2)(quantificazione del DNA tramite RT-PCR) 3)Amplificazione dei vari loci STR (PCR multiplex) 4)Preparazione dei prodotti di amplificazione per la loro separazione (elettroforesi) 5)Separazione dei prodotti di PCR (elettroforesi capillare) 6)Elaborazione del risultato della corsa elettroforetica 7)Valutazione del profilo Le fasi 1) e 2) oggi in alcuni casi non sono più necessarie (messa a punto di kit commerciali per amplificazione diretta dei loci STR)

25 Quanti loci tipizzare? USA  CODIS (Combined DNA Index System): 13 loci + amel UK  1° generazione: 8 loci + amelogenina, poi 10 loci + amel 8 loci in comune tra i due standard

26 Posizione sul genoma dei 21 loci autosomici del kit : 1 sul cromosoma 1 3 sul cromosoma 2 (TPOX-D2S441 distanza 66.7 Mb, R 0.47) 1 sul cromosoma 3 1 sul cromosoma 4 2 sul cromosoma 5 (distanza 26.5 Mb, R ca. 0.25) 1 sul cromosoma 6 1 sul cromosoma 7 1 sul cromosoma 8 1 sul cromosoma 10 1 sul cromosoma 11 2 sul cromosoma 12 (distanza 6.5 Mb, R ca. 0.12) 1 sul cromosoma 13 1 sul cromosoma 16 1 sul cromosoma 18 1 sul cromosoma 19 1 sul cromosoma 21 1 sul cromosoma 22 I kit di ultima generazione: il GlobalFiler Express della Life Technologies

27 ALLELIC LADDER del kit GlobalFiler Express

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29 I 23 loci STR (22 autosomici e 1 del cromosoma Y) amplificati dal kit Promega PowerPlex Fusion

30 Profilo ottenuto con il kit PowerPlex Fusion

31 31 Esempio di profilo di un soggetto di sesso femminile (1)

32 32 Esempio di profilo di un soggetto di sesso femminile (2)

33 Come viene calcolata? Attraverso l’analisi di un campione rappresentativo della popolazione si ottengono le frequenze alleliche (per conta diretta). Si calcolano poi le frequenze genotipiche attese dall’equilibrio di Hardy- Weinberg, a questo punto è possibile calcolare la PI Il complemento a 1 della PI è chiamato Potere di esclusione (PD) La Probabilità di identità (PI) è la Probabilità che 2 individui estratti a caso dalla popolazione abbiano lo stesso genotipo

34 Combined 6.18x10 -27 3.34x10 -24 3.71x10 -26 3.09x10 -26 Per ciascun locus la P i diminuisce all’aumentare del no. di alleli purché tutti gli alleli siano ‘frequenti’ Se due loci sono indipendenti la P i combinata viene calcolata con la regola del prodotto P i(locus 1) x P i(locus 2) Perché studiare tanti loci?

35 La probabilità di match casuale Il peso di una corrispondenza (match) tra un profilo di DNA Q e il profilo di un sospettato K è ‘quantificato’ in termini di probabilità Qual è la probabilità che un profilo come quello del DNA Q (trovato sulla scena di un crimine) sia uguale al profilo genetico di un individuo scelto a caso dalla popolazione? La P match è uguale alla frequenza del profilo Q nella popolazione (che è pari al prodotto della frequenza genotipica per gli n loci utilizzati per la costruzione del profilo stesso)

36 Esempio di calcolo di Probabilità di match 0.222x x2 = 0.1

37 Esempio di calcolo di Probabilità di match 1 / 79,531,528,960,000,000 1 / 101 / 1111 / 20 1 / 22,200 xx 1 / 1001 / 141 / 81 1 / 113,400 xx 1 / 1161 / 171 / 16 1 / 31,552 xx

38 Nei database sono archiviati i profili genetici di: Tracce biologiche da scene del crimine Persone scomparse Cadaveri non identificati Soggetti sottoposti ad arresto

39 Alcuni problemi che complicano l’interpretazione del profilo

40 La quasi totalità dei picchi presenta un picco estremamente basso alla sua sinistra (= frammento con una repeat in meno) raramente alla sua destra. Questi picchi vengono chiamati ‘stutter’ Come si originano?

41 Probabile meccanismo di produzione degli ‘stutter’

42 La propensione a produrre ‘stutter ‘ varia da locus a locus e da allele ad allele (alleli più lunghi sono più ‘a rischio’)

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44 Se il DNA è in eccesso l’adenilazione incompleta è più probabile

45 Problemi nell’interpretazione di profili STR Pattern ‘multiallelici’ Sono generalmente conseguenza della duplicazione della regione che contiene il microsatellite. E’ un fenomeno molto raro (almeno negli STR forensi autosomici standard) tuttavia, dato il gran numero di soggetti analizzati, in letteratura ne sono stati riportati diversi esempi Mistura di due campioni o pattern tri- allelico? Se si tratta di una mistura osserverò più di due alleli a più di un locus, viceversa il tri-allelismo interessa solo il locus soggetto a duplicazione 1 2 3

46 Problemi nell’interpretazione di profili STR Alleli ‘off ladder’ I triangolini rossi delimitano il range allelico noto per quello specifico locus, talvolta i range allelici di loci diversi sono molto vicini Un picco presente nello spazio tra due triangolini di loci diversi a quale locus deve essere attribuito?

47 La ‘perdita allelica’ (‘allele dropout’) Quando si osserva un solo picco in genere si conclude che l’individuo studiato è omozigote per il locus in questione, tuttavia potrebbe trattarsi di una omozigosi apparente: in realtà si è amplificato uno solo dei due alleli Possibile motivo  è presente una mutazione nella sequenza di appaiamento di uno dei due primer Problemi nell’interpretazione di profili STR

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49 La ‘perdita allelica’ dovuta a non amplificazione selettiva di uno dei due alleli sarebbe ininfluente se tutti i profili (di soggetti e di tracce biologiche) presenti in tutte le banche dati venissero ottenuti con lo stesso kit Un soggetto mostrerebbe sempre lo stesso profilo, cioè risulterebbe sempre omozigote per gli stessi loci (sia nel caso di omozigosi vera che di omozigosi apparente) Lo stesso soggetto analizzato con kit diversi deve dare sempre lo stesso profilo, un risultato discordante per un locus (eterozigote con un kit e omozigote con un altro) mette in evidenza una ‘perdita allelica’ molto probabilmente dovuta a mutazione nella regione di annealing di uno dei due primer (kit diversi usano primer che si appaiano in sequenze diverse, anche se sempre in regioni fiancheggianti il locus STR)

50 Problemi nell’interpretazione di profili STR Problemi tecnici in senso stretto Incapacità del detector nel risolvere appropriatamente i colori emessi dai fluorocromi utilizzati per marcare i primer Distaccamento dei fluorocromi dai primer con conseguente loro migrazione indipendente Cristalli di urea e bolle d’aria rilevabili come falsi picchi sottili nell’elettroferogramma (‘spike’) Contaminanti: sostanze normalmente non presenti nel polimero all’interno del capillare, fluorescenti nella regione visibile dello spettro

51 Reperti difficili 1.DNA degradato 2.DNA scarso 3.Campioni misti Situazioni molto comuni nelle indagini forensi di tipo investigativo

52 L’esposizione all’ambiente (acqua,batteri e funghi, UV, nucleasi) determina la progressiva degradazione del DNA Se il DNA è fortemente degradato potrebbero presentarsi problemi di amplificazione principalmente a carico dei microsatelliti che vengono amplificati negli ampliconi più grandi 1.DNA degradato Progressiva diminuzione dell’amplificato si può ricorrere a markers/strategie alternative -SNPs (ampliconi < 100 bp) - mtDNA (molte più copie rispetto al DNA nucleare) -«Mini-STRs» (STR amplificati con primer ridisegnati in modo da ottenere ampliconi più piccoli rispetto a quelli prodotti con i primer standard)

53 Mini STR 1.DNA degradato

54 Un campione di DNA è considerato LT-DNA quando la quantità di DNA disponibile per l’analisi è inferiore a 100-200 pg (pari al contenuto in DNA di 20-40 cellule diploidi) La PCR è in grado (con qualche difficoltà) di amplificare un bersaglio anche a partire da una sola cellula, tuttavia quando il numero di copie di DNA stampo è piccolo l’entità di amplificazione dei singoli loci e/o dei singoli alleli di ciascun locus è fortemente soggetta alle leggi del caso: interi loci o, peggio, singoli alleli possono non essere amplificati, oppure può verificarsi uno sbilanciamento tra alleli o un’amplificazione significativa degli stutter 2.DNA scarso o ‘low template’ DNA (LT-DNA)

55 2.LT-DNA Replicate #1 High stutter Consensus Profile: 14,197,9.312,1311,1324,Z Correct Profile: 14,197,9.312,1311,1318,24 Replicate #2 Replicate #3

56 Il DNA amplificato proviene da due o più soggetti Il profilo STR sarà a sua volta un ‘profilo misto’, con loci con più di 2 alleli L’altezza relativa dei picchi dell’elettroferogramma riflette in modo abbastanza preciso la quantità relativa di DNA dei due (o più) individui e permette di valutare se un determinato picco possa risultare dalla sovrapposizione di alleli provenienti da individui diversi Come conseguenza delle diverse possibili combinazioni di due (o più) genotipi ad un singolo locus, si verificheranno fenomeni di sbilanciamento allelico (es. mistura tra un omozigote 11/11 ed un eterozigote 10/11) 3.Reperti misti

57 Esempi di profili derivati da misture di DNA DNA (in proporzioni uguali) provenienti da due soggetti: per molti loci risulta impossibile stabilire il genotipo dei due individui DNA (in proporzioni diverse) provenienti da due soggetti: l’individuazione dei due genotipi ai singoli loci è possibile

58 Sono stati sviluppati kit per la determinazione del profilo Y-specifico kit Y-specifico della Promega  si ottiene un profilo a 23 loci STR kit Yfiler della Life Technologies  amplificazione di 17 loci STR

59 La capacità discriminatoria dei profili del cromosoma Y è estremamente più bassa di quella dei profili ottenuti con loci autosomici Nel primo caso vengono studiati loci in linkage assoluto cioè APLOTIPI: la variabilità si origina solo per mutazione Non possiamo utilizzare la regola del prodotto

60 John M. Butler, Carolyn R. Hill and Michael D. Coble Applied Genetics Group, National Institute of Standards and Technology, Gaithersburg, Maryland, USA Publication Date: 2012

61 61 Il potere discriminante del profilo del cromosoma Y è di gran lunga inferiore rispetto quello dei loci autosomici: permette di operare esclusioni (il profilo del sospettato e quello della traccia biologica sono diverse  il sospettato NON è colui che ha lasciato la traccia) ma non attribuzioni (il profilo del sospettato e quello della traccia biologica sono uguali  il sospettato potrebbe aver lasciato la traccia, ma potrebbero averlo fatto anche un suo parente in linea maschile e un certo numero di maschi dello stesso gruppo etnico, quanti? )

62 Perché ottenere profili Y-specifici? 1.Possibilità di fare inferenze sull’origine etnica del donatore di una traccia 2.Possibilità di ottenere un profilo certo da tracce miste maschio-femmina in cui il contributo del femminile è estremamente più elevato di quello maschile

63 E se non c’è un sospettato la genetica può aiutarci a stabilire alcune caratteristiche dell’autore del crimine? Etnia (mtDNA e cromosoma Y) Colore occhi (insieme di 6 SNP) Colore capelli (insieme di 6 SNP) Età? (lunghezza telomeri?)