CLONAGGIO POSIZIONALE

Presentazione sul tema: "CLONAGGIO POSIZIONALE"— Transcript della presentazione:

1 CLONAGGIO POSIZIONALE
CLONAGGIO FUNZIONALE

2 1 2 3 4 5 Identificazione di geni-malattia attraverso la strategia del clonaggio posizionale

3 Oggi è possibile passare direttamente dalla fase 1) alla fase 4)
Geni presenti in una regione di 500 kb del cromosoma 6 umano (6p21.1) I geni presenti all’interno della regione identificata con l’analisi di linkage vengono valutati e si stila un elenco di geni ‘candidati’

4 Come si stabilisce l’ordine di priorità dei geni candidati?
Funzione appropriata esempi rodopsina per la retinite pigmentosa; fibrillina per la sindrome di Marfan; gene per un canale ionico per la sordità Espressione spazio-temporale appropriata esempio  i geni le cui mutazioni determinano difetti del tubo neurale devono essere espressi in questa struttura prima della sua chiusura Omologie e relazioni funzionali con geni noti e di cui si conoscono mutazioni patologiche che danno fenotipi simili a quello che si sta studiando esempio  ligando e suo recettore; componenti di una stessa via metabolica Omologie con fenotipi simili in organismi modello

5 Omologie con fenotipi simili in organismi modello
Possibilità di creare topi knock-out o knock-in (anche condizionali)

6 Clonaggio posizionale in epoca pre-sequenziamento genoma umano
L’identificazione del gene della DMD (metà anni ‘80 ) Due gruppi sono arrivati in maniera indipendente a questo risultato 1) attraverso un paziente che aveva una delezione citologicamente rilevabile di una regione in Xp21 2) attraverso una delle rarissime donne (una ventina in tutto il mondo) che presentano la malattia

7 Kunkel et al PNAS 82: 1) hanno utilizzato il clonaggio per sottrazione (concettualmente semplice ma tecnicamente molto complesso)

8 Clonaggio per sottrazione
Il DNA 2. è in grande eccesso rispetto all’1: si favorisce la formazione di eteroduplex (1)-(2) rispetto a quella di omoduplex (1)-(1) 1. DNA di una linea cellulare 49, XXXXY digerito con MboI (frammenti con estremità adesive) 2. DNA del paziente DMD con la delezione (frammentato con sonicazione) I 2 DNA denaturati vengono mescolati e fatti rinaturare (A) Omoduplex (1)-(1), hanno estremità adesive: possono essere clonati in un vettore con estremità adesive complementari (B) eteroduplex (1)-(2), un filamento è privo di estremità adesive: non possono essere clonati (C) omoduplex (2)-(2), non hanno estremità adesive: non possono essere clonati Questi frammenti sono arricchiti per le sequenze che non sono presenti nel DNA 2, vengono utilizzati per la costruzione di una libreria

9 Le sequenze clonate sono state testate per individuare quelle realmente non presenti nel paziente con la delezione

10 Le sequenze così ottenute sona state usate come sonde di ibridazione su Southern blot di DNA di malati DMD e di controlli normali

11 Donna affetta da DMD portatrice di una traslocazione bilanciata X-21
Worton et al. 1987 Donna affetta da DMD portatrice di una traslocazione bilanciata X-21 Il punto di rottura sul cromosoma X è dentro il gene DMD Il tratto di cromosoma 21 traslocato porta geni per l’rRNA sul cromosoma X Costruzione di una libreria di DNA genomico della donna affetta Identificazione dei cloni contenenti sia sequenze del cromosoma X che sequenze per l’rRNA

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13 Anche in altri casi la scoperta di pazienti portatori di anomalie cromosomiche è stata fondamentale per l’individuazione di geni-malattia Se portatori di traslocazioni cromosomiche bilanciate presentano una malattia genetica mendeliana: La traslocazione non è bilanciata La rottura cromosomica ha spezzato un gene critico (o ha separato la sequenza codificante dalle regioni regolative, che possono trovarsi anche a grande distanza) La concomitante presenza della traslocazione e della malattia è casuale

14 Clonaggio funzionale  si arriva al clonaggio del gene malattia attraverso inferenze sulla funzione la cui alterazione provoca la patologia Pochi esempi  clonaggio del gene implicato in una grave forma di emofilia

15 Gene del fattore VIII della coagulazione – suo isolamento da una banca di cDNA in due fasi con sonda oligonucleotidica ‘lunga’ e ‘corta’ Isolamento del DNA genomico (di maiale) e suo uso come sonda per isolare il corrispondente gene umano

16 Attualmente la strategia più utilizzata per l’identificazione di geni malattia è quella del gene candidato posizionale Per le malattie dominanti ‘de novo’ si può procedere con una strategia di sequenziamento dell’esoma di padre-madre-figlio Talvolta si può prescindere dalla localizzazione cromosomica (fenotipo simile in organismi modello; malattie con eterogeneità genetica per cui uno dei geni coinvolti sia stato identificato)

17 Sequenziamento dell’esoma (soprattutto per malattie rare AD letali)

18 Il DNA del soggetto da analizzare viene frammentato
I frammenti sono utilizzati per costruire una libreria di DNA Le porzioni esoniche (con le introniche fiancheggianti) sono catturate tramite ibridazione con esche di DNA legate a biotina Gli eteroduplex DNA-esche biotinilate vengono catturate da biglie magnetiche rivestite da streptavidina

19 I complessi esche-DNA-biglie vengono rimossi usando un magnete
I frammenti del DNA da analizzare vengono separati dalle esche, eluiti e sequenziati sequenziamento

20 Preparazione di una libreria di DNA genomico
Purificazione del DNA di interesse Digestione parziale del DNA di interesse con un RE che crea estremità adesive Digestione del DNA del vettore con lo stesso RE Mescolamento dei due DNA  si formano (anche) molecole di DNA ricombinante vettore-frammento di DNA di interesse Trattamento con ligasi Inserimento del vettore (con o senza frammento del DNA di interesse) in cellule opportune (batteri o lievito)  trasformazione Selezione delle cellule che hanno il vettore ricombinante

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24 Esempio di vettore plasmidico pUC19

25 Un gene ‘candidato’ deve essere confermato attraverso lo studio comparativo della sua sequenza in pazienti e controlli

26 OMIM = Online Mendelian Inheritance in Man
Versione online del catalogo dei fenotipi mendeliani umani (la ‘Bibbia’ dei genetisti medici) edito in versione cartacea fin dal 1966 a cura di Victor McKusick (sei edizioni: la prima nel 1966, l’ultima nel 1998) E’ un compendio dei geni e dei fenotipi umani Contiene informazioni su > geni e su tutte le malattie e i fenotipi mendeliani noti

27 il significato della prima cifra:
Ogni voce (‘entry’) è contrassegnata da un numero a sei cifre preceduto da un simbolo il significato della prima cifra: e ‘entries’ create prima del 15/05/ riguardanti loci o fenotipi autosomici ‘entries’ riguardanti loci o fenotipi X- linked ‘entries’ di loci o fenotipi Y-linked ‘entries’ di loci o fenotipi mitocondriali ‘entries’ di loci o fenotipi autosomici creati dopo il 15/05/1994

28 il significato del simbolo che precede il numero:
* gene # fenotipo + gene a sequenza nota + fenotipo % fenotipo mendeliano a base molecolare nota no simbolo fenotipo a sospetta (ma non confermata) eredità mendeliana Esempi relativi alla CF (= Cystic Fibrosis) Il gene *602421 La malattia 1 (CF) #219700 La malattia 2 (CBAVD) #277180

29 Per ogni gene il database fornisce numerose informazioni cliniche, genetico-molecolari, popolazionistiche, una serie di ‘link’ ad altri siti e un’ampia bibliografia