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Cromatografia III
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Cromatografia liquida
Se si fa uso di particelle grosse ( μm), l'eluizione può essere fatta per gravità. Se si fa invece uso di particelle medie (40-60 µm) la separazione è migliore, ma l'eluizione per gravità è troppo lenta. Si applica quindi una pressione moderata (2-3 atm). La pressione viene realizzata in genere mediante pompe peristaltiche. Questa tecnica è molto usata nei laboratori di chimica organica. Vantaggi: basso costo; semplice; adatta per scopi preparativi. Svantaggi: lentezza; non adatta per scopi quantitativi; bassa risoluzione.
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Cromatografia liquida
Scambio ionico / interazioni polari
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Cromatografia a percolazione
Le colonne usate sono di lunghezza variabile da qualche decimetro a più di un metro. Deposizione del campione seguita da eluente. Flusso ottenuto per gravità. Si raccolgono frazioni. Le frazioni vengono analizzate da tecniche non in linea
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Matrici Agarosio E’ un polisaccaride derivante da particolari alghe rosse cosituito da residui alternati di D-galattoso e 3,6-anidro-L-galattoso. Disponibilità commerciale: Sepharose, Sepharose CL (cross-linking con 2,3-dibromopropanolo), Superose, Bio-Gel A. Limiti di esclusione kD. Cellulosa Polimero di unita’ glucosidiche unito da legami -1,4. Tramite epicloridrina vengono ottenuti i legami crociati essenziali per l’ utilizzo come matrice in cromatografia, il numero dei quali determina la dimensione dei pori. Destrano E’ un polimero di residui di glucosio uniti da legami -1,6 prodotto dal batterio Leuconostoc mesenteroides. E’ presente in commercio con il nome di Sephadex. La porosita’ dei gel a base di destrano e’ controllata dalla massa molecolare del destrano usato e dall’ introduzione di legami crociati ottenuti con epicloridrina. Limiti di esclusione kD. Il cosiddetto Sephacryl e’ destrano con legami crociati ottenuti con N,N’-metilene bisacrilamide. Limiti di esclusione kD. Il Superdex e’ un gel composito costituito da destrano covalentemente legato ad agarosio. Poliacrilamide E’ un polimero di acrilamide e N,N’-metilenbisacrilamide (quest’ultimo determina la formazione di legami crociati). E’ disponibile in commercio come Bio-GelP, con limiti di esclusione tra 0.2 e 400 kD. Polistirene E’ un polimero di stirene legato con divinilbenzene. Silice E’ un polimero prodotto a partire dall’acido ortosilicico. I molti gruppi silanolo (Si-OH) rendono la matrice altamente idrofilica. Il loro eccesso puo’ essere eliminato derivatizzando con triclorometilsilano.
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Matrici agarosio sephadex sephacryl
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HPLC CROMATOGRAFIA LIQUIDA AD ALTA EFFICIENZA
Vantaggi rispetto alla LC classica: velocità, risoluzione e sensibilità superiori. A B C Cromatografia classica a colonna aperta riempita con particelle grandi, porose (d > 150 mm, D = mm, L = cm). HPLC con riempimento pellicolare (d = mm, D = 1-3 mm, L = cm). HPLC con riempimento di microparticelle (d = 5-10 mm, D = 2-6 mm, L = cm). d = diametro particelle; D = diametro colonna; L = lunghezza colonna
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HPLC LC classica: dimensione delle particelle e diametro interno della colonna molto maggiori che nella HPLC; velocità di flusso molto basse; tempi di analisi lunghi. Cercando di aumentare la velocità del solvente, diminuiscono efficienza e risoluzione a causa del limitato trasporto di massa nei pori profondi e nei lunghi canali interparticellari. HPLC: impaccamento di dimensioni molto inferiori, compresso in colonne sottili; contropressioni maggiori; tempi d’ analisi contenuti. Per favorire il flusso della fase mobile è quindi necessario l’uso di pompe ad alta pressione. Efficienza aumentata di e tempi di separazione diminuiti (miglioramento nei termini di trasporto di massa della fase stazionaria e della fase mobile).
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Caratteristiche HPLC Elevata risoluzione Analisi rapide
Fase stazionaria (o matrice di supporto) costituita da particelle molto piccole 3 – 10 μm Colonne di piccolo diametro mm Pressioni di ingresso elevate Precisione nell’introduzione del campione Portata della fase mobile controllata Rivelatori in linea Elevata risoluzione Analisi rapide
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HPLC Vantaggi Rapidità e precisione in analisi quantitative
Tipico tempo di analisi di min. Precisione (errore < 0,5 - 1%) Analisi automatizzate Usando autocampionatori ed elaboratori di dati Alta sensibilità Limite di rivelabilità (LOD) di ng a pg Recupero del campione quantitativo Tecniche preparative da µg a g Adatta a diversi tipi di campioni Può analizzare più del 60% di tutti i composti contro il 15% della GC
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Cromatogramma HPLC
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Cromatografo
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Schema Cromatografo HPLC
COMPARTIMENTO TERMOSTATATO PRECOLONNA SERBATOIO SOLVENTE COLONNA REGISTRATORE INIETTORE POMPA FILTRO MISURATORE PRESSIONE SPURGO RIVELATORE COLLETTORE DI FRAZIONI
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Valvola a iniezione Posizione di carica Posizione di introduzione
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Colonne Effetto della lunghezza
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Fase stazionaria Liquida Solida difficile evitare il trascinamento
particelle porose (Ø μm) – alta caduta di pressione particelle pellicolari (vetro o polimero non poroso rivestito da un sottile strato poroso) Ø 40 μm bassa caduta di pressione
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Colonne monolitiche Maggiore permeabilita’ minore tempo di analisi
Colonne piu’ lunghe
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Colonna “tipo” bar
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Fase normale e fase inversa
■Usa silica, alumina, fasi legate amino-, ciano-, o fenil • Usa fasi mobili non polari come esano, CH2Cl2 modificato con isopropanolo • Analiti polari hanno tempi di ritenzione più lunghi ■ Eccellente per analiti non polari, isomeri, separazione in gruppi omogenei in polarità Fase normale Fase inversa
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Eluizione a gradiente L’eluizione a gradiente si contrappone all’eluizione normale (isocratica). SOLVENTE DEBOLE SOLVENTE FORTE FORZA INTERMEDIA GRADIENTE DI SOLVENTE
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Rivelatori Proprietà di massa Proprietà soluto
Caratteristiche fase mobile Caretteristiche specifiche soluto Ind. Rifr.; Cost. dielettr.; Densità UV-Vis.; Fluoresc.; Elettroch.
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Rivelatore a UV-Visibile
Sorgenti: lampade a Hg; D; W Lunghezza d’onda variabile A serie di diodi (DAD)
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Rivelatore a rifrazione
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Applicazioni farmaceutiche
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Applicazioni
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