Parte 7 Interpretazione dei profili genetici

Parte 7 Interpretazione dei profili genetici
Genetica Forense (6 CFU) – Fulvio Cruciani Laurea Triennale in Scienze Biologiche Sapienza Università di Roma

Problemi nell’interpretazione di profili STR
Purtroppo, non sempre si ottiene un risultato di facile interpretazione come quello dell’esempio OK

A. Problemi «biologici» A.1: prodotti «stutter». Durante la PCR, come conseguenza dello scivolamento della polimerasi nell’amplificare ripetizioni in tandem (fenomeno analogo a quello che porta alla mutabilità in natura dei microsatelliti) si ottengono alcuni prodotti PCR più corti di un’unità rispetto al numero di ripetizioni dell’allele amplificato. In genere, il prodotto dello stuttering ha un’altezza inferiore al 15% del picco «reale» (almeno per gran parte dei loci validati in ambito forense).

A. Problemi «biologici» A.1: prodotti «stutter». In genere i «reverse» stutter sono maggiormente visibili dei «forward» stutter

A. Problemi «biologici» A.1: prodotti «stutter». Gli stutter presentano intensità diversa per microsatelliti diversi, sono più evidenti nei «tri» che nei «tetra»-nucleotide repeats e sono più evidenti per gli alleli più lunghi

A. Problemi «biologici» A.1: prodotti «stutter» Problemi nell’interpretazione dei profili dovuti alla presenza di stutter: Generalmente gli stutter sono facilmente interpretati come tali negli elettroferogrammi, e non rappresentano un problema. Ci sono tuttavia alcune situazione in cui potrebbero portare ad errori di interpretazione: In presenza di DNA scarso In presenza di un eccesso di DNA Nei profili misti, soprattutto se sbilanciati Al contrario, in alcuni casi, gli stutter potrebbero essere anche d’aiuto nell’interpretazione del profilo, permettendo ad esempio di distinguere alleli «veri» da picchi nell’elettroferogramma dovuti a «pull up» o a sbalzi di voltaggio.

Esempio di pattern «triallelico»

A. Problemi «biologici» A.2: Pattern «multiallelici» Sono spesso conseguenza della duplicazione della regione che contiene uno dei microsatelliti della multiplex (CNV). Le duplicazioni possono essere intra- o inter-cromosomiche. In alcuni casi si può trattare di aneuploidie (es. sindrome di Down). In alternativa potrebbero essere conseguenza di mosaicismo somatico o germinale. Per quanto si tratti di un fenomeno relativamente raro (almeno nei microsatelliti forensi standard) sono state riportate in letteratura decine di differenti pattern triallelici. Si osserva mediamente un triallelico ogni mille profili (per multiplex 15-STR autosomici) 1 2 3 Type 1 sbilanciata Type 2 bilanciata Punti da considerare: Differenza rispetto alle misture di campioni Problemi per il calcolo delle probabilità alleli off ladder estremi

A. Problemi «biologici» A.3: Aggiunta di adenina al 3’ incompleta La Taq polimerasi in genere aggiunge al 3’ del filamento PCR neosintetizzato un’adenina. Le multiplex STR sono ottimizzate in modo che questo avvenga regolarmente. Può accedere tuttavia in alcuni casi che si verifichi un’adenilazione incompleta dei prodotti PCR, che da luogo, per ciascun allele a due picchi distanziati di una sola base nell’elettroferogramma. Questo avviene spesso nel caso di un eccesso di DNA stampo Incomplete adenylation D8S1179 -A +A Punti da considerare: Un picco più corto di una base rispetto al normale potrebbe essere interpretato come una «microvariante» STR diversi possono comportarsi in modo diverso Soluzioni: lunga estensione finale nella PCR promuove +A; oppure G al 5’ del primer non marcato promuove +A; Utilizzazione di una polimerasi che non aggiunga A al 3’

A. Problemi «biologici» A.4: Alleli «off ladder» Sono alleli che presentano un numero minore (alleli “below ladder”) o maggiore (“above ladder”) di ripetizioni di quante ne siano presenti nei ladder commerciali per multiplex STR. Sono considerati “off ladder” anche gli alleli con una lunghezza dell’amplicone PCR tale da ricadere tra due alleli del ladder (microvarianti o alleli “between ladder”), generalmente dovuti a piccole inserzioni o delezioni nell’amplicone. Punti da considerare: Potrebbe essere difficile assegnare alleli below o above ladder ad un locus piuttosto che ad un altro Alleli off ladder estremi potrebbero essere assegnati ad un locus errato, o portare a falsi pattern «triallelici» Errori nell’assegnazione del numero di repeats below ladder between-ladder Allelic ladder above ladder

A. Problemi «biologici» A.5: Alleli nulli In presenza di una mutazione al 3’ del sito di annealing di uno dei due primers utilizzati per amplificare un STR, la Taq polimerasi non è in grado di sintetizzare il prodotto PCR. La conseguenza può essere quella che solo uno dei due alleli STR vengono amplificati. (vedi slide successiva per figura). In alternativa, gli alleli nulli possono essere dovuti anche a delezioni più o meno estese. Punti da considerare: Kit differenti per STR multiplex con diversi set di primers: concordance studies Problemi per il confronto con databases: stringenza della ricerca di match Problemi nei test di paternità Da non confondere con il drop out allelico dovuto a DNA stampo scarso

J.M. Butler (2009) Fundamentals of Forensic DNA Typing
Printed 12/29/2018 Alleli nulli o sbilanciati dovuti a mutazioni nel sito di annealing di un primer * 8 6 Allele 6 amplicon has ‘dropped out’ Imbalance in allele peak heights Heterozygous alleles are well balanced No mutation Mutation at 3’-end of primer binding site (allele dropout) Mutation in middle of primer binding site (a) (b) (c) (Tratto da Butler 2010) Impact of a sequence polymorphism in the primer binding site illustrated with a hypothetical heterozygous individual possessing a ‘6,8’ genotype. Arrows represent PCR primers in different positions around the STR repeat region. Heterozygous allele peaks may be (a) well-balanced, (b) imbalanced, or (c) exhibit allele dropout. A ‘null allele’, such as shown in (c), can be detected through use of different PCR primers. Contribution of the National Institute of Standards and Technology, 2010

Concordance studies: Risultati della genotipizzazione del locus D18S51 utilizzando tre diversi kit forensi

Problemi biologici nell’interpretazione dei profili
Alleli nulli CASE STUDY (3) Nel 2000, in due diverse popolazioni del Guam studiate con il kit forense Profiler Plus, che coamplifica 9 STRs, si è osservato un significativo eccesso di genotipi omozigoti rispetto all’atteso secondo Hardy-Weinberg per un singolo locus (D8S1179). L’analisi mediante sequenziamento Sanger ha permesso di evidenziare, in corrispondenza del 3’ del sito di legame del primer reverse, un polimorfismo dovuto ad una sostituzione nucleotidica G-A, a 56 basi dal microsatellite stesso. La presenza dell’allele mutato portava alla mancata amplificazione dell’allele STR sulla stessa molecola di DNA Per risolvere il problema è stato sufficiente sostituire il primer originario per il locus D8S1179 con uno localizzato più a monte.

B. Problemi «tecnici» B.1: “pull up”: Incapacità di risolvere appropriatamente nei giusti colori la luce emessa dai fluorocromi utilizzati per marcare i primers. in campioni sovraccarichi (Vedi dia successiva) B.2: “Dye blobs”: Dovuti al distaccamento dei fluorocromi dai primers con conseguente loro migrazione indipendente. (Vedi dia successiva) B.3: Spikes da cristalli di urea: portano alla comparsa di picchi sottili nell’elettroferogramma. B.4: Spikes elettrici: dovuti a sbalzi di voltaggio, rilevabili come picchi sottili attraverso tutti i colori (Vedi dia successiva) B.5: Contaminanti: Sostanze normalmente non presenti nel polimero all’interno del capillare, fluorescenti nella regione visibile dello spettro.

Printed 12/29/2018 Spettri di emissione dei fluorocromi Applied B. in uso nel kit AmpFlSTR. I filtri virtuali sono rappresentati dalle quattro colonne nere centrate sul picco dello spettro di ciascuno dei 4 fluorocromi. A causa della sovrapposizione degli spettri, una matrice di deconvoluzione (4 x 4) deve essere utilizzata per una corretta interpretazione dei dati. 520 540 560 580 600 620 640 WAVELENGTH (nm) 100 80 60 40 20 310 Filter Set F with color contributions 5-FAM JOE NED ROX Laser excitation (488 nm, nm) Normalized Fluorescent Intensity Figure 9.8 Fluorescent emission spectra of ABI dyes used with AmpFlSTR kits. The virtual filters for ABI 310 Filter Set F is represented by the four boxes centered on each of the four dye spectra. Each dye filter contains color contributions from adjacent overlapping dyes that must be removed by a matrix deconvolution. The dyes are excited by an argon ion laser, which emits light at 488 and 514.5nm.

Esempio di pull up ai loci TH01 e vWA

Esempio di dye blob al locus FGA
Esempio di dye blob al locus FGA. La forma del picco è generalmente più allargata di quella dei picchi allelici e manca di stutter

Esempio di spikes elettrici
Esempio di spikes elettrici. Il picco è più sottile di quello degli alleli e si trova in tutti i canali in posizioni corrispondenti

Printed 12/29/2018 Dye blob STR alleles stutter Pull-up (bleed-through) Electric spike Blue channel Green channel Yellow channel Red channel Butler 2009, Figure 10.5 Hypothetical electropherogram displaying several artifacts often observed with STR typing. Two primary biological artifacts of the PCR amplification process with STRs are stutter and incomplete adenylation that causes split peaks (inset). Contribution of the National Institute of Standards and Technology, 2010

Situazioni molto comuni nelle indagini forensi di tipo investigativo
Reperti difficili: DNA scarso DNA degradato Misture di DNA Situazioni molto comuni nelle indagini forensi di tipo investigativo Quali strategie (tecniche e computazionali) possono essere utilizzate per risolvere casi in cui sono coinvolti campioni di questo tipo?

DNA scarso

(Low Copy Number ~ Low template)
Reperti difficili: 1. DNA scarso (Low Copy Number ~ Low template) Si parla di «low template» DNA (LT-DNA) quando la quantità di DNA disponibile per l’analisi è inferiore a pg (il contenuto in DNA di cellule diploidi). Sebbene la PCR sia in grado (con qualche difficoltà) di amplificare un bersaglio a partire da una sola cellula, il problema principale del LT-DNA è quello della sensibilità del metodo.

Reperti difficili: DNA scarso
Il «Touch DNA» è una classe di LT-DNA che può essere repertato a partire da oggetti che siano stati semplicemente «maneggiati» o «toccati». Le cellule che vengono repertate in questi casi sono generalmente in piccolissimo numero e di tipo epiteliale. Touch DNA può essere ad esempio recuperato da un arma utilizzata in un delitto o dal volante di un’automobile. Soggetti diversi differiscono per la loro capacità di «rilasciare» cellule epiteliali (individui «shedder» e «non-shedder») Trasferimento primario: Modo standard di deposizione di materiale biologico da una persona ad un oggetto Trasferimento secondario: trasferimento di materiale biologico da una persona ad un’altra persona e quindi ad un oggetto (es. «stretta di mano») che viene campionato. Il trasferimento secondario, laddove avvenga, da generalmente luogo a misture fortemente sbilanciate

CASE STUDY (4): L’omicidio di Mr Kumra: Trasferimento secondario di DNA Nel dicembre 2012, basandosi su evidenze genetiche ed un match Q-database, un senza tetto di nome Lukis Anderson venne accusato dell’omicidio di Raveesh Kumra, un milionario della Silicon Valley. Ma Anderson aveva un alibi molto solido: ubriaco e quasi comatoso, la notte del delitto era ricoverato in ospedale e sotto costante supervisione medica. Dopo sei mesi di prigione, il suo team legale dimostrò che il suo DNA arrivò sulla scena del crimine attraverso i paramedici che erano intervenuti nella residenza di Kumra e che avevano trattato Anderson poche ore prima. Il caso, presentato nel mese di febbraio all' annuale American Academy of Forensic Sciences riunitasi a Las Vegas, fornisce un esempio di trasferimento secondario di DNA che ha portato all’implicazione di una persona innocente.

CASE STUDY (5): Il fantasma di Heilbronn: uno sfortunato caso di trasferimento primario Nel 2007 venne ucciso ad Heilbronn (Germania) un agente della polizia locale. Si osservò che il profilo di DNA dell’omicida ignoto era di tipo femminile e corrispondeva a quello ritrovato in almeno altri 6 omicidi (uno dei quali commesso nel 1993) ed in diversi furti di varia entità. Nessun testimone aveva mai visto una donna nelle circostanze criminose, da cui originò il soprannome di «fantasma di Heilbronn». Che qualcosa non andasse si capì chiaramente quando il profilo genetico ottenuto a partire dall’impronta digitale di un maschio noto risultò corrispondere ancora ad una volta al fantasma di Heilbronn. Il mistero fu risolto quando si realizzò che in tutti i casi il materiale biologico sulla scena del crimine era stato repertato utilizzando dei tamponi prodotti da una ditta austriaca. Risultò che una dipendente della ditta, addetta al confezionamento dei tamponi, aveva involontariamente trasferito sui tamponi il proprio DNA che era stato poi rilevato dai laboratori forensi Fictioned in «CSI: New York», ‘Dead Reckoning’ episode

Sono stati adottati diversi accorgimenti tecnici per cercare di ottenere un risultato attendibile a partire da una bassa quantità di DNA: Incremento del numero di cicli della PCR (es. da 28 a 31 cicli) Nested PCR, con coppie di primer «interni» Iniezione di volumi maggiori di campione nella elettroforesi capillare Purificazione post-PCR e concentrazione del DNA OPPURE Cambiare completamente sistema polimorfico e passare al mtDNA (Perché?) (l’analisi del mtDNA verrà affrontata in una successiva lezione) Si parla di «low template» DNA (LT-DNA) quando la quantità di DNA disponibile per l’analisi è inferiore a pg (il contenuto in DNA di cellule diploidi). Sebbene la PCR sia in grado (con qualche difficoltà) di amplificare un bersaglio a partire da una sola cellula, il problema principale del LT-DNA è quello della sensibilità del metodo. Un’alternativa agli STR, in caso di LT_DNA, può essere l’analisi di mtDNA (nota: l’analisi del mtDNA verrà affrontata successivamente) Perché? Vantaggi e svantaggi

Contenuto in DNA nucleare dei campioni biologici:
Tipo di campione Quantità di DNA Sangue ng/mL macchia 1 cm2 200 ng macchia 1 mm2 2 ng Liquido seminale ng/mL tampone vaginale postcoitale ng/tampone Capelli capello strappato capello perso ng/capello ng/capello Saliva Urine Cellula umana diploide DNA necessario per analisi STR standard ~ 0.5 ng ng/mL ng/mL ~7 pg

Problemi: I problemi sono tutti relativi al piccolo numero di copie del DNA stampo. L’entità di amplificazione dei singoli loci (e dei singoli alleli di ciascun locus) è soggetta alle leggi del caso. Drop out allelico: solo uno dei due alleli di un eterozigote viene amplificato Drop out di locus: un intero locus non viene amplificato Sbilanciamento allelico: in un eterozigote, i due alleli sono rappresentati da picchi di altezza molto diversa Drop in allelico da stutter: lo stutter si amplifica in modo sproporzionato e può venir scambiato per un allele Drop in allelico da contaminazione: un DNA contaminante in basso numero di copie si amplifica efficacemente portando alla comparsa di un «falso» allele

Peak Imbalance Drop-out High Stutter Drop-in
Severe Peak Imbalance Allelic Drop-out High Stutter Allelic Drop-in 30% peak height ratio 64% stutter 16 allele drop-in 14 allele drop-out Figure 11.2 Stochastic effects that randomly occur when PCR amplifying low amounts of DNA using an increased number of PCR cycles. The STR typing kit, amount of DNA, and number of PCR cycles along with the correct genotype for each example are listed at the bottom. For further information on these samples, see Identifiler, 30 pg DNA, 31 cycles Identifiler, 30 pg DNA, 31 cycles Identifiler, 10 pg DNA, 31 cycles Identifiler, 10 pg DNA, 31 cycles Correct genotype: 10,11 12,14 12,13 18,19

Off-scale data (leads to artifacts) DNA amount (log scale) Sbilanciamento allelico e drop in come conseguenza dell’aumento del numero dei cicli della PCR 10 ng 1 ng 0.1 ng 0.01 ng (100 pg) (10 pg) Optimal data Allele drop-out Allele imbalance Figure 11.1 Illustration of hypothetical results at a heterozygous locus (two alleles expected in each box) with various levels of input DNA and detection sensitivity that is modulated through increasing the number of PCR cycles. Note that off-scale data occurs with lower amounts of DNA as the detection sensitivity is increased. Locus drop-out Allele drop-in 28 cycles 31 cycles 34 cycles Detection Sensitivity

Soglia analitica (espressa in RFU) Soglia stocastica (espressa in RFU)
Reperti difficili: DNA scarso In questa situazione, per minimizzare gli errori di attribuzione del genotipo, si utilizzano diversi tipi di «soglie» Soglia analitica (espressa in RFU) Soglia stocastica (espressa in RFU) Soglia stutter (espressa in %) Soglia per lo sbilanciamento allelico (espressa in %) Valore massimo per la detection (espressa in RFU) Ricorda: le soglie vanno definite sperimentalmente; inoltre le soglie per il LT DNA potrebbero differire da quelle utilizzate nell’analisi standard Ad ogni modo, in presenza di LT DNA, l’utilizzazione delle soglie non assicura l’attribuzione di un genotipo corretto

Definizione delle soglie I
Soglia analitica (Analytical Threshold, AT) Valore, espresso in RFU, che permette di discriminare, con idoneo grado di confidenza un segnale analitico (allele) dal rumore di fondo; in altri termini AT rappresenta il valore minimo che un segnale analitico deve assumere per poter essere affidabilmente considerato un allele Soglia che consente l’attribuzione di un valore al segnale analitico nell’ elettroferogramma. Al di sotto di questo valore, i picchi osservati non possono essere distinti chiaramente dal rumore di fondo AT Esempio di soglia analitica (AT) calcolata in 175 RFU per questa combinazione colore/kit

Definizione delle soglie II
Soglia stocastica (Stochastic threshold, ST) Valore, espresso in RFU, al di sopra del quale è ragionevole assumere, con idoneo grado di confidenza (es. 99%), che gli effetti stocastici e, soprattutto, il fenomeno del drop-out allelico non si sono verificati Singoli alleli al di sopra della ST possono essere considerati omozigoti ST

Definizione delle soglie III
Soglia bande stutter Valore, espresso in termini relativi (%), al di sopra del quale è ragionevole assumere, con idoneo grado di confidenza (es. 99%), che gli artefatti stutter non vengano rilevati (segnali in posizione stutter > tale soglia sono da considerarsi veri segnali allelici) Soglia che consente di discriminare i veri segnali allelici dagli stutter (che rappresentano la categoria più frequente di artefatti nella tipizzazione di loci STR) Gli stutter presentano una intensità locus/allele/kit/procedura dipendente. La soglia del 15% non sempre appare adeguata

Definizione delle soglie IV
Soglia per lo sbilanciamento allelico Rapporto, espresso in termini relativi (%), al di sopra del quale è ragionevole assumere che due segnali rappresentino due alleli di un eterozigote con idoneo grado di confidenza. Può essere espresso come rapporto tra il picco con intensità minore e quello con intensità maggiore (Peak Height Ratio, PHR). Esempio di sbilanciamento allelico al locus D16S539 PHR = 5773/10258 = 58% Nelle analisi standard si utilizza generalmente una soglia pari al 60%, inferiore in caso di LT DNA

DNA scarso: ottenere un profilo consenso
Reperti difficili: DNA scarso: ottenere un profilo consenso Un metodo molto utilizzato per aumentare l’affidabilità dei test su LT-DNA consiste nel fare delle repliche dalle quali dedurre un profilo consenso. Tipicamente, vengono fatte 3 PCR differenti e prodotti altrettanti profili mediante i quali viene costruito un «profilo consenso», nel quale siano riportati come «reliable» sono quegli alleli che compaiono in più di una replica (vedi dia successiva)

LT-DNA: generazione di un profilo consenso
Reperti difficili: LT-DNA: generazione di un profilo consenso Replicate #1 High stutter Replicate #2 Modificato da Butler (2012). Figure 11.3 Three replicate PCR amplifications of a 10 pg single source DNA template using the Identifiler kit (only green loci shown) and 31 cycles. The consensus profile, produced by recording all alleles that occurred at least two out of three times, matched the correct profile (note that the consensus wildcard “Z” for D2S1338 appropriately covers the allele 18 that has drop-out twice). The red arrows indicate positions of allele dropout and the blue arrows where severe peak height imbalance was observed. Replicate #3 Consensus Profile: 14,19 7,9.3 12,13 11,13 24 Correct Profile: 14,19 7,9.3 12,13 11,13 18,24

Reperti difficili: DNA degradato

Reperti difficili: 2. DNA degradato
Il nucleo delle cellule diploidi umane contiene 46 molecole di DNA a doppio filamento (cromosomi) di lunghezza compresa tra 48 Mbasi (cromosoma 21) e 249 Mbasi (cromosoma 1). Mediante un processo di estrazione di DNA standard, a partire da materiale biologico ben conservato, il DNA dei singoli cromosomi si spezzetta per produrre frammenti di DNA della lunghezza dell’ordine delle decine di migliaia di basi, che possono essere evidenziate su un gel d’agarosio come bande discrete ad alto peso molecolare Il processo di degradazione del DNA può essere evidenziato su gel come uno smear dovuto alla presenza di molecole di peso molecolare basso e molto differente. Se il DNA è fortemente degradato, la maggior parte delle molecole avrà una lunghezza molto contenuta anche di poche basi

Reperti difficili: 2. DNA degradato
L’esposizione all’ambiente (acqua, batteri e funghi, UV, nucleasi) determina la progressiva degradazione del DNA. In presenza di DNA degradato, il vantaggio dell’utilizzazione di marcatori «corti» quali gli STRs è evidente. Se il DNA è fortemente degradato, potrebbero presentarsi dei problemi di amplificazione utilizzando le multiplex STRs, principalmente a carico dei microsatelliti in ampliconi più grandi. Progressiva diminuzione dell’amplificato

Reperti difficili: DNA degradato
In situazioni di forte degradazione, si può ricorrere a markers/strategie alternative rispetto agli STR convenzionali In questi casi si possono utilizzare: SNPs (ampliconi < 50 basi) mtDNA (l’elevato numero di copie rispetto al nucleare aumenta la probabilità che i primer si appaino ad un segmento di DNA «sufficientemente lungo») «Mini-STRs» (STR con primer ridisegnati in modo da ottenere ampliconi più piccoli di quelli utilizzati normalmente) Altre possibilità: aree protette da nucleosomi, riparazione del DNA Base pairs Differenti Markers RFLP (minisat multi-locus) 50 100 500 1000 D1S80 STRs miniSTRs SNPs

Reperti difficili: DNA degradato Mini STR

Mistura “Don’t do mixture interpretation unless you have to!” (Peter Gill, UK FSS, 1998)

Reperti difficili: Misture
Quando due o più individui hanno contribuito al campione in esame si parla di campioni misti o «misture». Il profilo STR relativo a questi campioni sarà a sua volta un «profilo misto», nel quale potranno facilmente essere evidenziati loci con un numero di alleli > 2. Importanza dei sistemi multiallelici nell’analisi di misture L’altezza relativa dei picchi dell’elettroferogramma riflette in modo abbastanza preciso la quantità relativa di DNA dei due (o più) individui nella mistura, e permette di valutare se un determinato picco possa risultare dalla sovrapposizione di alleli provenienti da individui diversi. Come conseguenza delle diverse possibili combinazioni di due (o più) genotipi ad un singolo locus, si verificheranno fenomeni di sbilanciamento allelico (es mistura tra un omozigote con ripetizioni 10/10 ed un eterozigote 10/11). La maggior parte delle misture coinvolge solo due individui

Steps per l’interpretazione di profili misti 1. Identificare la presenza di una mistura 2. Designare gli alleli nell’elettroferogramma 3. Stabilire il numero di individui coinvolti (e il loro sesso) 4. Stimare il contributo relativo dei diversi individui alla mistura 5. Considerare tutte le possibili combinazioni genotipiche 6. Confrontare con campione di riferimento 7. Determinare il peso statistico di eventuali compatibilità

Steps per l’interpretazione di profili misti 1. Identificare la presenza di una mistura Il più forte indizio di mistura è la presenza di più loci nel profilo con più di due alleli A seconda del tipo di mistura potrebbero anche verificarsi: Sbilanciamento degli ampliconi paraloghi X e Y dell’amelogenina, ad esempio nel caso di misti maschio-femmina Presenza di eterozigoti apparenti sbilanciati Presenza di picchi in posizione stutter insolitamente alti (dovuti in realtà ad un vero allele del contribuente minore in posizione stutter rispetto al contribuente maggiore)

Steps per l’interpretazione di profili misti 2. Designare gli alleli nell’elettroferogramma La designazione degli alleli in un profilo misto procede in modo analogo a quello visto per i profili singoli, tenendo quindi conto di tutti i possibili artefatti biologici e tecnici che possono osservarsi in un elettroferogramma. Particolare cura sarà necessaria per l’interpretazione degli alleli in posizione stutter, soprattuto se in presenza di una mistura fortemente sbilanciata.

Steps per l’interpretazione di profili misti 3. Stabilire il numero di individui coinvolti (e il loro sesso) La maggior parte delle misture osservate nelle indagini genetico forensi ha interessato fino ad oggi due soli soggetti. Per determinare il numero (minimo) di individui coinvolti è possibile osservare il numero di alleli osservati a singoli STR: 3 oppure 4 alleli almeno 2 individui 5 oppure 6 alleli almeno 3 individui (2n-1) o 2n alleli almeno n individui All’aumentare del numero di contribuenti alla mistura, tuttavia, la probabilità di rilevare un numero di alleli adeguato si riduce, ed è funzione del numero di STR analizzati oltreché del loro numero di alleli ed eterozigosità. In misture che coinvolgono maschi, per conoscere il numero dei contributors maschili, si può ricorrere a Y-STRs (vedi lezione su Y)

Steps per l’interpretazione di profili misti 3. Stabilire il numero di individui coinvolti (e il loro sesso) Il locus dell’amelogenina può essere utilizzato per avere informazioni sul sesso degli individui implicati nella mistura. Se nella mistura è coinvolta una femmina, il picco amel-X sarà SEMPRE più alto (salvo fluttuazioni casuali o anomalie genetiche). Se fossero coinvolti solo maschi si osserverebbero SEMPRE due picchi amel-X e amel-Y bilanciati (salvo fluttuazioni casuali o anomalie genetiche). Nel caso di coinvolgimento di sole femmine, sarebbe presente esclusivamente il picco amel-X. L’amelogenina può essere anche utile per comprendere quale sia il contributore maggiore e minore in una mistura sbilanciata maschio-femmina

Da Butler (2015) Forensic DNA typing: interpretation

Steps per l’interpretazione di profili misti 4. Stimare il contributo relativo dei diversi individui alla mistura In base al contributo relativo degli individui coinvolti nella mistura queste possono essere: Misture bilanciate (contributo approssimativamente uguale) Misture sbilanciate (contributo differente) Mistura bilanciata Mistura sbilanciata

CASE STUDY (6): Misture sbilanciate, touch DNA, interrogazione di banche dati Un ignoto armato di coltello stuprò una donna anziana nella sua casa nel nord dell' Inghilterra. La donna fu trascinata dall’aggressore e successivamente trovata in strada, vestita solo del suo reggiseno e maglione. La donna non riuscì ad identificare l'autore del reato al di là di una descrizione generale. Non venne trovato sperma sui tappeti della casa, sui tamponi medici della vittima o sul maglione della vittima. Poiché era stata trascinata, c'era la possibilità che si fosse depositato del DNA «touch» sulle superfici relativamente ruvide delle parti in pizzo del reggiseno che furono repertate ed analizzate. L' analisi del DNA rivelò un profilo di DNA maggioritario corrispondente alla vittima femminile e un profilo maschile minoritario ma completo che venne usato per interrogare la banca dati nazionale del DNA e fu trovato corrispondere ad un pregiudicato che si dichiarò colpevole prima del processo.

Steps per l’interpretazione di profili misti 4. Stimare il contributo relativo dei diversi individui alla mistura Per stimare il contributo relativo di due individui in una mistura sbilanciata si può considerare l’altezza (RFU) dei picchi in tutti i loci in cui siano visibili 4 alleli e fare delle proporzioni, assumendo che l’altezza dei picchi sia proporzionale alla quantità di DNA stampo. Si utilizza la «mixture ratio» MR estesa a tutti i loci con 4 alleli (D1S1656 e D2S441 nell’esempio a sinistra): MR D1S= ( ) / ( ) = 1.85 MR D2S= ( ) / ( ) = 1.57 MR = (MR D1S + MR D2S)/2 = 1.71 Quindi nell’esempio il contributo relativo delle due persone coinvolte nella mistura è pari 1.71:1

Steps per l’interpretazione di profili misti 5. Considerare tutte le possibili combinazioni genotipiche Una volta designati gli alleli, il numero di contributori e il contributo relativo di questi, si devono considerare i possibili genotipi compatibili con le osservazioni. Ci sono due possibili approcci principali: «Unrestricted»: Si tiene conto dei soli alleli, senza considerare la loro altezza relativa (2) «Restricted»: Si tiene conto dell’altezza relativa dei diversi alleli I due approcci si potranno utilizzare sia nel caso di misture bilanciate che di misture sbilanciate, con risultati diversi.

Steps per l’interpretazione di profili misti 5. Considerare tutte le possibili combinazioni genotipiche

Steps per l’interpretazione di profili misti 5. Considerare tutte le possibili combinazioni genotipiche Per ciascun locus, esistono 16 differenti possibili combinazioni genotipiche per due individui (30 combinazioni considerando le 14 reciproche) Reciproche = 0 Reciproche = 3 Reciproche = 6 Reciproche = 3 Nell’approccio unrestricted verranno considerate tutte le possibilità, mentre nell’approccio restricted verranno scartate alcune combinazioni genotipiche

Steps per l’interpretazione di profili misti 5. Considerare tutte le possibili combinazioni genotipiche Esempio A : B MR = 1.7 D3S1358 Unrestricted: A = 15,15; B = 16,16 A = 15,16; B = 15,15 A = 15,16; B = 16,16 A = 15,16; B = 15,16 A = 16,16; B = 15,15 A = 15,15; B = 15,16 A = 16,16; B = 15,16 Restricted:

Steps per l’interpretazione di profili misti 5. Considerare tutte le possibili combinazioni genotipiche Esempio A : B MR = 1.7 D1SS1656 Unrestricted A = 13,14; B = 15,16.3 A = 13,15; B = 14,16.3 A = 13,16.3; B = 14,15 A = 15,16.3; B = 13,14 A = 14,16.3; B = 13,15 A = 14,15; B = 13,16.3 Restricted

Steps per l’interpretazione di profili misti 5. Considerare tutte le possibili combinazioni genotipiche D1SS1656 Unrestricted A = 13,14; B = 15,16.3 A = 13,15; B = 14,16.3 A = 13,16.3; B = 14,15 A = 15,16.3; B = 13,14 A = 14,16.3; B = 13,15 A = 14,15; B = 13,16.3 CONTRIBUTORE NOTO Spesso nelle misture uno dei soggetti che ha contribuito al profilo è noto e può quindi essere utilizzato per diminuire il numero delle possibili combinazioni genotipiche attraverso un processo di sottrazione. Nell’esempio a destra, se il soggetto noto fosse eterozigote 14,15 al locus D1S1656, Potremmo eliminare le altre 5 possibili combinazioni genotipiche ed al contempo determinare il genotipo del contributore ignoto che sarebbe 13,16.3

Steps per l’interpretazione di profili misti 5. Considerare tutte le possibili combinazioni genotipiche Complicazioni nella deconvoluzione delle misture: La maggior parte delle misture sono molto più complesse degli esempi visti finora. Misture fortemente sbilanciate. Può diventare difficile attribuire gli alleli della componente minoritaria a causa di (1) allele sharing; (2) allele drop out; (3) sovrapposizione in posizione stutter Misture nelle quali una parte dei contributori presenta degradazione. In questo caso è più complesso calcolare una Mixture Ratio e quindi attribuire i genotipi Misture nelle quali tutti i contributori sono rappresentati da quantità minime di DNA, in cui i problemi tipici del LT-DNA si sovrappongono a quelli tipici delle misture Misture sbilanciate, LT-DNA e con degradazione differenziale!!

Steps per l’interpretazione di profili misti 5. Considerare tutte le possibili combinazioni genotipiche Complicazioni nella deconvoluzione delle misture: Se si trattasse di una mistura sbilanciata 5:1 che coinvolge due persone potremmo assegnare con una certa confidenza i genotipi. MA se invece si trattasse di una mistura fortemente sbilanciata 10:2:1 che coinvolge 3 persone? Gli alleli del contributore minore potrebbero essere sovrapposti agli stutter, oppure essere mascherati, senza che sia possibile rilevarli, dagli alleli del contributore maggiore. Se fossimo in condizioni di LT-DNA, potrebbe anche essersi verificato un drop out allelico del contribuente minore

Steps per l’interpretazione di profili misti 6. Confrontare con campione di riferimento Ottenute tutte le possibili combinazioni genotipiche per la mistura in esame, queste vanno confrontate con il genotipo del sospettato/i Come nelle analisi convenzionali, escludendo le misture non interpretabili (risultato inconcludente), i possibili risultati del confronto saranno di ESCLUSIONE Uno o più loci STR del sospettato hanno un genotipo non presente tra i genotipi rilevati nella mistura COMPATIBILITA’ Tutti i loci STR del sospettato presentano un genotipo che sia stato rilevato nella mistura In quest’ultimo caso, deve essere dato un peso statistico all’evidenza di compatibilità, con modalità simili, ma non identiche, a quelle viste in precedenza per i casi che non coinvolgono misture

7. Determinare il peso statistico di eventuali compatibilità
Misture 7. Determinare il peso statistico di eventuali compatibilità

Steps per l’interpretazione di profili misti
Misture Steps per l’interpretazione di profili misti 7. Determinare il peso statistico di eventuali compatibilità Approccio 1: RMP Se è possibile arrivare alla completa deconvoluzione della mistura nelle sue componenti, ed un sospettato risultasse compatibile con uno dei profili, per determinare il peso statistico è possibile ricorrere alla «random match probability» come se si trattasse di un semplice match K-Q visto in precedenza Ricordiamo che la RMP risponde alla domanda: Qual’è la probabilità che un profilo come quello osservato corrisponda al profilo genetico di un individuo preso a caso dalla popolazione? Ovvero, quant’è frequente quel genotipo nella popolazione? Come visto, per calcolare la RMP, si applica la regola statistica del prodotto nell’assortire gli alleli nei singoli loci ed i singoli loci tra di loro, assumendo equilibrio H-W e linkage equilibrium tra loci

Steps per l’interpretazione di profili misti
Misture Steps per l’interpretazione di profili misti 7. Determinare il peso statistico di eventuali compatibilità Approccio 1: RMP Esempio: Genotipi restricted: D8S1179: 10,14 e 12,15 D21S11: 30,31 e 28,32.2 Genotipo contributor noto: D8S1179: 10,14 D21S11: 30,31 Genotipo contributor ignoto per sottrazione: D8S1179: 12,15 D21S11: 28,32.2 Database frequenze alleliche D8S1179*: Frequenza allele 12 = p = 0.4 Frequenza allele 13 = q = 0.1 Frequenza allele 15 = r = Database frequenze alleliche D21S11 Frequenza allele 28 = s = 0.3 Frequenza allele 32.2 = t = 0.5…. * Nota: le frequenze riportate non sono reali Random match probability 2 x p x r x 2 x s x t = 2 x 0.4 x 0.2 x 2 x 0.3 x 0.5 = 0.048

approccio «Random Man Not Excluded» (RMNE = CPI)
Misture Steps per l’interpretazione di profili misti 7. Determinare il peso statistico di eventuali compatibilità approccio 2: approccio «Random Man Not Excluded» (RMNE = CPI) Nell’approccio RMNE si restituisce una probabilità che risponde alla domanda: Quale frazione della popolazione NON sarebbe esclusa (ovvero sarebbe inclusa) come potenziale contributore della mistura Q osservata? In questo approccio vengono considerati solo gli alleli (tutti i possibili) e non si tiene conto né del numero di contributori, né si tenta una deconvoluzione in genotipi Osservati n (possibili) alleli ad un locus in una mistura, vengono considerate tutte le possibili combinazioni di coppie di alleli (ovvero tutti i possibili genotipi) Possibili genotipi dati n alleli: n x (n + 1) / 2 Di cui: n omozigoti e n x (n - 1) / 2 eterozigoti

Misture Steps per l’interpretazione di profili misti 7. Determinare il peso statistico di eventuali compatibilità Approccio 2: approccio «Random Man Not Excluded» (RMNE = CPI) In questo approccio vengono considerati solo gli alleli (tutti i possibili) e non si tiene conto né del numero di contributori, né si tenta una deconvoluzione in genotipi. Questo approccio si potrebbe utilizzare ad esempio nella mistura osservata in precedenza nella quale si sospetta n > 2 contributori e non è possibile stabilire con certezza quali siano gli alleli del/dei contributori minori Considerando come possibili alleli tutti i picchi osservati (anche quelli in posizione stutter), avremmo 7 possibili alleli e 28 possibili combinazioni genotipiche. Se chiamiamo le frequenze dei 7 alleli nella popolazione p,q,r,s,t,u,v, la probabilità che un «uomo casuale non venga escluso» (che prende il nome di CPI - Combined Probability of Inclusion) sarà pari a CPI = (p + q + r + s + t +u + v)2

Misture Steps per l’interpretazione di profili misti 7. Determinare il peso statistico di eventuali compatibilità Approccio 2: approccio «Random Man Not Excluded» (RMNE = CPI) Nell’approccio RMNE si utilizza la Combined Probability of Inclusion (CPI) CPI = quadrato della somma delle frequenze di tutti gli alleli della mistura La CPI viene considerata una misura conservativa e può essere utilizzata in misture molto complesse che coinvolgano un numero elevato di contributori, ma ha il difetto di non tenere in debita considerazione tutte le informazioni rilevabili in una mistura. Nel caso di LT DNA non tiene conto di eventuali drop out. CPI = (p + q + …. + n)2

Approccio 2: approccio RMNE
Misture Steps per l’interpretazione di profili misti 7. Determinare il peso statistico di eventuali compatibilità Approccio 2: approccio RMNE Esempio (diverso da quello del RMP): Alleli osservati: D3S1358: 12,14,15 D18S51: 28,29,30 Se non è possibile fare la deconvoluzione e non si fanno assunzioni sul numero di contributori, si può utilizzare la RMNE Per ciascun locus si considerano tutte le possibili combinazioni genotipiche degli alleli osservati a ciascun locus e la loro frequenza assumendo HW. Database frequenze alleliche D3S1358: Frequenza allele 12 = p = 0.2 Frequenza allele 14 = q = 0.1 Frequenza allele 15 = r = Database frequenze alleliche D18S51: Frequenza allele 28 = s = 0.3 Frequenza allele 29 = t = 0.1 Frequenza allele 30 = v = 0.1 CPI (Combined Probability of Inclusion) (p + q + r)2 x (s + t + v)2 = ( )2 x ( ) 2 = 0.36 x 0.25 = 0.09

Approccio 3: Likelihood Ratio (LR)
Misture Steps per l’interpretazione di profili misti 7. Determinare il peso statistico di eventuali compatibilità Approccio 3: Likelihood Ratio (LR) Il LR è un numero (non una probabilità) che esprime il rapporto tra la probabilità che si verifichi un evento sotto due diverse ipotesi che si escludono a vicenda. In genetica forense l’evento può essere il profilo genetico osservato (che venga da una single-source o da una mistura), e le due ipotesi sono quelle dell’accusa (Hp) e quelle dell’attesa (Hd) Ad esempio, nel caso di un profilo single-source, sia l’accusa che la difesa riconoscono il match tra il profilo Q e quello del sospettato ma: Ipotesi dell’accusa: Il match Q-K osservato è dovuto al fatto che il DNA osservato sulla scena del crimine appartiene al sospettato. Ipotesi della difesa: Il match Q-K osservato è casuale ed il DNA osservato sulla scena del crimine appartiene ad una persona sconosciuta

Misture Steps per l’interpretazione di profili misti 7. Determinare il peso statistico di eventuali compatibilità Approccio 3: Likelihood Ratio (LR) Ipotesi dell’accusa: Il match Q-K osservato è dovuto al fatto che Il DNA osservato sulla scena del crimine appartiene al sospettato. Ipotesi della difesa: Il match Q-K osservato è casuale ed il DNA osservato sulla scena del crimine appartiene ad una persona qualsiasi sconosciuta Nella prima ipotesi la probabilità di osservare un match sarà ovviamente pari a 1 Nella seconda ipotesi, la probabilità di osservare casualmente un match tra Q ed il sospettato sarà pari alla frequenza del profilo nella popolazione generale (ovvero = RMP) Nella sua formulazione più semplice quindi, semplicemente LR = 1/RMP

Misture Steps per l’interpretazione di profili misti 7. Determinare il peso statistico di eventuali compatibilità Approccio 3: Likelihood Ratio (LR) Nel riportare «qualitativamente» i risultati di un valore LR alla corte sono state suggerite le seguenti linee guida: Ad esempio con un LR di 5000 c’è forte supporto (qualitativo) e si dirà (quantitativamente) che il risultato osservato è 5000 volte più probabile se il sospettato sia la fonte del DNA rinvenuto piuttosto che lo sia qualcun altro. Se LR è… Per l’ipotesi dell’accusa si ha… Da 1 a 10 Limitato supporto Da 10 a 100 Moderato supporto Da 100 a 1000 Supporto moderatamente forte Da 1000 a 10000 Forte supporto > 10000 Supporto molto forte

Reperti difficili: Misture

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