Che cosa è un momento magnetico di spin = - S SPIN S=1/2 Momento angolare di spin Momento magnetico di spin S= [S(S+1)] ½ h/2.

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1 Che cosa è un momento magnetico di spin = - S SPIN S=1/2 Momento angolare di spin Momento magnetico di spin S= [S(S+1)] ½ h/2

2 Quantizzazione Il concetto di spin è associato alla meccanica quantistica, ovvero alla fisica che descrive il comportamento dei sistemi con particelle infinitamente piccole ovvero non trattabili con le regole della fisica classica. In accordo alla meccanica quantistica, lenergia della interazione tra il momento magnetico di spin ed il campo magnetico non puo essere qualsiasi, ma puo assumere solo valori definiti NO

3 Quantizzazione Il concetto di spin è associato alla meccanica quantistica, ovvero alla fisica che descrive il comportamento dei sistemi con particelle infinitamente piccole ovvero non trattabili con le regole della fisica classica. In accordo alla meccanica quantistica, lenergia della interazione tra il momento magnetico di spin ed il campo magnetico non puo essere qualsiasi, ma puo assumere solo valori definiti E= - B cos S(S+1)] 1/2 ħ B cos E= ħ m B m=+1/2, -1/2

4 Quantizzazione Quindi, quando uno particella con uno spin S=1/2 è immersa in un campo magnetico, ci sono solo due valori di Energia possibili (permessi) E= - B cos S(S+1)] 1/2 ħ B cos E= ħ m B m=+1/2, -1/2 E= ħ B

5 NMR-active nuclei with different spin numbers I=1/2 1 1 H, 13 6 C, 31 15 P, 19 9 F, 15 7 N I=3/2 23 11 Na 35 17 Cl I=5/2 17 8 O 27 13 Al

6 Alcuni Isotopi e loro proprietà

7 Rapporto giromagnetico E= ħ m B E= ħ B La separazione in energia dipende dal valore del rapporto giromagnetico

8 B0B0 E = B 0 E = mB 0 :m = +½ +½ E ½ B 0 :m = ½ ½ E ½ B 0 Ogni momento magnetico precede intorno al campo magnetico statico B 0 Spin equivalenti precedono tutti con la stessa velocità 0 anche se ciascuno con una fase diversa equivalenti significa nuclidi di atomi identici CH3CH2OHCH3CH2OH La frequenza di precessione di Larmor

9 I parametri NMR Il chemical shift Le costanti di accoppiamento La intensità dei segnali

10 La frequenza di precessione di un determinato nucleo ad un determinato campo magnetico è detta FREQUENZA DI PRECESSIONE DI LARMOR Frequenza di precessione 0 = - B 0 /2π Se cosi fosse, ogni nucleo attivo entrerebbe in risonanza con il campo esterno alla sua frequenza e tutti gli isotopi uguali si comporterebbero allo stesso modo (un unico segnale). Es: al campo magnetico di 11.7 T, La FREQUENZA DI PRECESSIONE DI LARMOR del nuclide 1 H è 500 MHz.

11 La costante di schermo

12 Costante di schermo = Costante di schermo Dipende dallintorno elettronico

13 Chemical shift ref ref ppm Es: 1 = 500.131 MHz 0 =500.13 MHz 1 - 0 =1000 Hz = 1000/500.13x10 6 (ppm)= 2.0

14 TMS (Tetramethylsilane) chemical shift

15 Fattori che influenzano il chemical shift Caratteristiche funzionali Effetti attraverso lo spazio Effetti paramagnetici

16 Effetti induttivi

17 Effetti Mesomeri

18 Fattori che influenzano il chemical shift Caratteristiche funzionali Effetti attraverso lo spazio Effetti paramagnetici

19 Anisotropia di schermo indotta dai legami chimici

20 Correnti danello

21 Frequenze di risonanza

22 NMR in macromolecole biologiche

23 The amount of shielding the nucleus experiences will vary with the density of the surrounding electron cloud If a 1 H nucleus is bound to a more electronegative atom e.g. N or O as opposed to C, the density of the electron cloud will be lower and it will be less shielded or deshielded. These considerations extend beyond what is directly bonded to the H atom as well. Simple shielding effects--electronegativity N H C H more electron withdrawing-- less shielded less electron withdrawing-- more shielded

24 less shielded higher resonance frequency more shielded lower resonance frequency amides (HN) aliphatic/alpha/beta etc.(HC) most HN nuclei come between 6-11 ppm while most HC nuclei come between -1 and 6 ppm. Simple shielding effects--electronegativity

25 One consequence of these effects is that aromatic protons, which are attached to aromatic rings, are deshielded relative to other HC protons. In fact, aromatic ring protons overlap with the amide (HN) region. aromatic region (6-8 ppm) amide region (7-10 ppm) More complex shielding effects: Aromatic protons

26 Amino acid structures and chemical shifts note: the shifts are somewhat different from the previous page because they are measured on the free amino acids, not on amino acids within peptides

27 Average or random coil chemical shifts in proteins One reason for this dispersion is that the side chains of the 20 amino acids are different, and these differences will have some effect on the H shift. The table at right shows typical values observed for different protons in the 20 amino acids. These were measured in unstructured peptides to mimic the environment experienced by the proton averaged over essentially all possible conformations. These are sometimes called random coil shift values. Note that the H shifts range from ~4-4.8, but H shifts in proteins range from ~3 to 5.5. So this cannot entirely explain the observed dispersion.

28 poorly dispersed amides poorly dispersed aromatics poorly dispersed alphas poorly dispersed methyls very shielded methyl unfolded ubiquitin folded ubiquitin so you can tell if your protein is folded or not by looking at the 1D spectrum...

29 A simple reason for the increased shift dispersion is that the environment experienced by 1 H nuclei in a folded protein (B) is not the same as in a unfolded, extended protein or random coil (A). shift of particular proton in folded protein influenced by groups nearby in space, conformation of the backbone, etc. Not averaged among many structures because there is only one folded structure. So, some protons in folded proteins will experience very particular environments and will stray far from the average. shift of particular proton in unfolded protein is averaged over many fluctuating structures will be near random coil value

30 13 C NMR The rules discussed for 1 H spins, (shielding and deshielding effects) hold also for 13 C spins. Some general features of 13 C should be pointed out: Unlike 1 H atoms, 13 C atoms may form a different number and type of chemical bonds. Therefore, the shielding/deshielding effects are much more effective. The chemical shift range of 13 C spins spans more than 200 ppm

31 Range of observed shifts for 13 C

32 A protein 13 C NMR spectrum (low resolution) Backbone CO and side chain COO- signals Aromatic signals Aliphatic

33 13 C NMR The rules discussed for 1 H spins, (shielding and deshielding effects) hold also for 13 C spins. Some general features of 13 C should be pointed out: The amino acid dependence of chemical shift values is stronger for 13 C atoms than in 1 H atoms. Therefore, each amino acid has an almost unique pattern of 13 C chemical shifts

34 13 C chemical shifts are residue- specific

35 Lezione 5-8

36 I parametri NMR Il chemical shift Le costanti di accoppiamento La intensità dei segnali Il rilassamento

37 Costanti di accoppiamento

38 Accoppiamento scalare

39 2J2J 3J3J 3J3J

40

41 1 J HC 1 J HN 1 J CC

42 Accoppiamento scalare 13 C 1H1H

43 Accoppiamento scalare 13 C 1H1H

44 Accoppiamento scalare 1H1H 13 C S I

45 Accoppiamento scalare

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47 Accoppiamento scalare omonucleare 3 J H N H 2 J H H

48 Accoppiamento scalare 2J2J 3J3J 3J3J

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52 Costante di accoppiamento scalare Accoppiamento scalare 2 spin sono accoppiati per effetto di una interazione elettronica, ovvero per effetto di un legame chimico Questi effetto è generalmente osservabile per nuclei che distano fino a 3 legami sigma. Il fenomeno dellaccoppiamento scalare si esprime attrvaerso una constante di accoppiamento J Es H N -H 3J = 3-10 Hz LA costante di accoppiamento scalare ha come effetto la formazione di un doppietto. Ovvero ogni spin non appare come un singolo picco ma come un doppietto, le cui componenti sono separate in Hertz, dalla costante di accoppiamento 3-10 Hz

53 Accoppiamento scalare e rilassamento T 2 La larghezza di riga di un segnale NMR dipende dalle proprietà di rilassamento T 2. In prima approssimazione, il T 2 dipende a sua volta dalle dimensione della molecola studiata. Piu la molecola è grande, piu il T 2 è corto e piu i segnali sono larghi In una proteina, la larghezza di riga di un Hn o di un Ha è tipicamente maggiore di 10 Hz, ovvero della separazione del doppietto. In queste condizioni, laccoppiamento scalare non da luogo a doppietti osservabili 3-10 Hz 15 Hz MW ca. 5000 20-35 Hz MW. 10-20000

54 Fine lezione 5. 8/4/2010

55 N

56 N Importante 3 J dipendono dallangolo diedro INFORMAZIONE STRUTTURALE IMPORTANTE PER RISOLVERE LE STRUTTURE

57 3 J H N H = Acos 2 + B cos +C

58 Costanti di accoppiamento in sistemi uniformemente arricchiti in 13 C ed in 15 N

59 Costanti di accoppiamento 3 J Razionale Le costanti di accoppiamento scalare sono, da un punto di vista quantitativo, dipendenti dallangolo diedro sotteso tra i quattro atomi coinvolti C C H H Strategia La misura quantitativa di una costante daccoppiamento 3J fornisce informazioni sul valore dellangolo diedro coinvolto, ovverosia fornisce una informazione strutturale diretta ESEMPIO: 3 J HnHa 3-6 Hz in eliche 9-12 Hz in foglietti

60 Costanti di accoppiamento The scheme of 1J scalar couplings

61 Rilassamento

62 T 1 and T 2 T 2 describes the time evolution of magnetization in the xy plane, where acquisition takes place. It can be observed directly in the FID (linewidth) T 1 describes the time evolution of magnetization in the z axis. This can only be observed if a final 90° pulse is applied to rotate the magnetization from the z axis to the xy plane. The intensity of the overall magnetization on the z axis is related to the overall energy of the system. i.e. the populations of ground and excited states The intensity of the magnetization on the xy axis is related to the rate of dephasing of the magnetization.

63 x -y z B0B0 A Pulse x E E B1B1 x -y z B0B0 A Pulse x B1B1 x -y z B0B0 A Pulse x B1B1 x -y z B0B0 A Pulse x B1B1 x -y z B0B0 A Pulse x B1B1 x -y z B0B0 A Pulse x E E x -y z B0B0 A Pulse x x -y z B0B0 A Pulse x x -y z B0B0 A Pulse x x -y z B0B0 A Pulse x x -y z B0B0 A Pulse E E

64 Rilassamento Il sistema reagisce alla perturbazione applicata per tornare allequilibrio Rilassamento T 1 La constante di velocità con cui la magnetizzazione ritorna allequilibrio

65 T 1 T 1 describes the time evolution of magnetization in the z axis. Related to the overall energy of the system The populations of ground and excited states

66 x -y z B0B0 A Pulse x E E B1B1 x -y z B0B0 A Pulse x B1B1 x -y z B0B0 A Pulse x B1B1 x -y z B0B0 A Pulse x x -y z B0B0 A Pulse x receiver x -y z B0B0 A Pulse x receiver x -y z B0B0 A Pulse x receiver x -y z B0B0 A Pulse x receiver x -y z B0B0 A Pulse x receiver x -y z B0B0 A Pulse x

67 Rilassamento Il sistema reagisce alla perturbazione applicata per tornare allequilibrio Rilassamento T 2 La constante di velocità con cui la magnetizzazione scompare dal piano xy My=exp(-t/T 2 )

68 T 2 T 2 describes the time evolution of magnetization in the XY plane. In addition to the exchange of energy with the environment, nuclei exchange energy one with another. This does NOT affect the energy of the system but contributes to relaxation It can be observed directly in the FID (linewidth) T 2 is alwayes shorter or equal to T 1.

69 zy xzy xzy x M B1B1B1B1 90°t I I t

70 The NMR spectrum The Fourier Transform of the FID provides the NMR spectrum I 1 ½ F max ( ) FID Spectru m

71 Da ricordare La larghezza di riga di un segnale dipende dal valore del tempo di rilassamento T 2. Tanto piu T 2 é lungo, ovvero tanto piu il sistema impiega tempo per tornare allo stato di equilibrio, tanto piu la riga NMR é stretta. Una riga stretta permette al segnale di essere osservato con maggiore accuratezza INOLTRE……

72 Da ricordare Se un segnale ha un T 2 molto piccolo, sarà impossibile osservare gli accoppiamenti scalari perché il sistema rilassa durante la osservazione dell effetto.

73 I Meccanismi di rilassamento

74 Campi Magnetici Oscillanti

75 Anisotropia dello Spostamento Chimico (CSA)

76 Velocità di Rilassamento 15 N in Calbindin D 9K

77 Moti in Scala ns-ps del Citocromo b 5 (Fe 3+ ) Aumenta Mobilità

78 Moti in Scala ns-ps del Citocromo b 5 (Fe 2+ ) Aumenta Mobilità

79 Fine lezione 6 12/4/10

80 I parametri NMR Il chemical shift La intensità dei segnali Accoppiamento Scalare Il rilassamento Accoppiamento Dipolare

81 Accoppiamento scalare Accoppiamento dipolare

82 Accoppiamento Dipolare B0B0B0B0 I J r

83 Due spin vicini nello spazio, interagiscono in misura inversamente proporzionale alla sesta potenza della distanza. Questo effetto è anche chiamato effetto NOE (Effetto Overhauser nucleare). B0B0B0B0 I J r

84 Accoppiamento Dipolare Due spin vicini nello spazio, interagiscono in misura inversamente proporzionale alla sesta potenza della distanza. Questo effetto è anche chiamato effetto NOE (Effetto Overhauser nucleare). B0B0B0B0 I J r Per effetto della dipendenza dalla sesta potenza, si tratta di un effetto che è molto importante quando i due spin sono vicini e che diventa trascurabile quando la distanza aumenta.

85 Accoppiamento Dipolare Due spin vicini nello spazio, interagiscono in misura inversamente proporzionale alla sesta potenza della distanza. Questo effetto è anche chiamato effetto NOE (Effetto Overhauser nucleare). B0B0B0B0 I J r Limportanza di questo accoppiamento è enorme, perché se io riesco a misurare questo effetto, ottengo una informazione quantitativa sulla distanza.

86 Accoppiamento dipolare A differenza dellaccoppiamento scalare, laccoppiamento dipolare altera la popolazione dei livelli del sistema e non i valori di energia Da un punto di vista fisico, é laccoppiamento tra due magneti che sono vicino nello spazio

87 Accoppiamento dipolare Reference experiment Saturation of signal S

88 Accoppiamento dipolare Laccoppiamento dipolare si ha tra due spin che sono vicini nello spazio Si tratta della interazione tra due dipoli magnetici, tra i quali, quando essi sono vicini nello spazio, si ha uno scambio di energia Lentità delleffetto dipende dal campo magnetico e dalle dimensioni della molecola. Nel caso di spin 1H, laccoppiamento dipolare si trasferisce per spin che si trovano a distanze inferiori ai 5 A. NON si osservano doppietti Laccoppiamento dipolare da luogo ad un trasferimento di magnetizzazione da uno spin allaltro. Questo effetto va sotto il nome di effetto NOE Nuclear Overhauser Effect Perturbo A Aumenta la intensità di B

89 Accoppiamento dipolare Laccoppiamento dipolare è indipendente dallaccoppiamento scalare 2 spin possono essere accoppiati : -Scalarmente E dipolarmente se sono vicini nello spazio e legati da legami chimici -scalarmente ma non dipolarmente se sono legati da legami chimici ma non vicini nello spazio -dipolarmente ma non scalarmente se sono spazialmente vicini ma non legati da legamei chimici Pensate a degli esempi, per favore Leffetto NOE è osservabile in un esperimento NMR bidimensionale, detto NOESY (in realtà si puo anche osservare in esperimenti monodimensionle (1D NOE) di cui pero non parleremo

90 Accoppiamento scalare ed accoppiamento dipolare Laccoppiamento scalare è laccoppiamento tra spin nucleari che avviene tra atomi che sono legati da legami chimici (THROUGH BOND) E laccoppiamento tra spin determinato dagli orbitali molecolari, ovvero le energie dei livelli di spin nucleari sono interdipendenti Porta alla formazione di doppietti e multipletti. Puo essere sfruttato per trasferire magnetizzazione da uno spin ad un altro, sfruttando il trasferimento atraverso legami chimici Laccoppiamento dipolare è laccoppiamento tra spin nucleari che avviene tra atomi che sono vicini nella spazio (THROUGH SPACE) E laccoppiamento tra due dipoli magnetici che sono vicini tra di loro Puo essere sfruttato per trasferire magnetizzazione da uno spin ad un altro, in funzione della loro prossimità spaziale

91 Through space AND throuhg bonds Through space Through bond

92 Ricapitolando Cosa sappiamo sulle informazioni ottenibili via NMR che possono darci informazioni strutturali

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95 Esperimento NMR

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97 Di che cosa abbiamo bisogno? Un Nucleo NMR-attivo Un campo magnetico statico B 0 Un trasmettitore di radiofrequenza PRINCIPI DI BASE

98 Parole Chiave Esperimenti in Onda continua ed in Trasformata di Fourier PRINCIPI DI BASE

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100 Trasformata di Fourier

101 Thank you, Mr. Fourier! F( ) F(t)

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105 FOURIER TRANSFORMATIONS F( )= ( 0 ) F( )=A (sin )/ centered at 0 F( )=T 2 /1+(2 T 2 ) 2 -i 2 (T 2 ) 2 /1+(2 T 2 ) 2 0 F(t)=exp(-t/T 2 ) F(t)=exp(-t/T 2 )exp(i2 A )

106 Why bother with FT? FT allows to decompose a function in a sum of sinusoidal function (deconvolution). In NMR FT allows to switch from the time domain, i.e. the signal emitted by the sample as a consequence of the radiofrequency irradiation and detected by the receiving coil to the frequency domain (NMR spectrum) The FT allows to determine the frequency content of a squared function

107 Aspetti delle Trasformate di Fourier importanti per NMR Una somma di onde, puo essere decomposta nelle singole onde che lhanno generata e puo essere convertita in una serie di frequenze Una radiazione elettromagnetica v applicata per un tempo corto ha la proprietà di eccitare non solo la frequenza v ma anche tutte le frequenze intorno Tanto piu limpulso è corto e tanto più è largo il range di frequenze eccitate La Trasformata di Fourier del prodotto di due funzioni è uguale al prodotto delle trasformate delle due funzioni

108 A real F.I.D.

109 Parole Chiave Impulso Trasformata di Fourier PRINCIPI DI BASE

110 Parole Chiave Frequenza di Larmor Precessione del segnale (evoluzione del Chemical shift) PRINCIPI DI BASE

111 Esperimento NMR Lo stato del sistema allequilibrio Ovvero: campione nel campo magnetico, prima di fare lesperimento Consideriamo solo un singolo spin. Per esempio un campione contenente solo H 2 O

112 Esperimento NMR Leffetto di un IMPULSO è di portare il sistema fuori dallequilibrio La magnetizzazione di H 2 O è ruotata. Tanto piu lungo è limpulso applicato tanto maggiore sarà la rotazione

113 Importante Il segnale osservato nellesperimento NMR è il segnale che si trova sul piano xy

114 Esperimento NMR IMPULSO a 90° IMPULSO a 180°

115 Segnale ricevuto Se la radiofrequenza applicata è esattamente la frequenza di Larmor, si osserva nel tempo un segnale che tende a decadere (vedi dopo). Questo segnale è confrontato con la frequenza del rotating frame e la frequenza di risonanza del segnale è proprio quella del rotanting frame Il fatto che il segnale deacde dipende da un meccanismo, chiamato rilassamento, che saraà discusso in seguito My=exp(t/T2) Time (t) Fourier Transformation Frequency ( ) =0

116 Segnale ricevuto Se invece la magnetizzazione che studiamo ha una frequenza di risonanza diversa da quella dellimpulso di eccitazione, si osserverà un segnale alla frequenza obs=( 1- 0) My=cos( obs )texp(t/T2) Time (t) Fourier Transformation Frequency ( ) My=cos( obs )texp(t/T2) =0 = obs

117 Free Induction Decay (FID) Observed NMR signal in the time domain Resonance frequencies are acquired as a function of time Common case of observed FIDs t tt

118 The NMR Experiment After the pulse is switched off, the magnetization precesses in the xy plane and relaxes to equilibrium The current induced in a coil by the magnetization precessing in the xy plane is recorded. It is called FID. zy xzy xzy x M B1B1B1B1 90°t I I t To have a spin transition, a magnetic field B 1, oscillating in the range of radiofrequencies and perpendicular to z, is applied (perturbing pulse) The B 1 field creates coherence among the spins (they all have the same phase) and net magnetization in the x,y plane is created

119 FT relax. PreparationDetection x y z t2t2 0

120 Pulse! -y y The rotation of magnetization under the effect of 90° pulses according to the convention of Ernst et al..

121 Signal to noise

122 ScansS/N 1 1.00 80 8.94 8 2.83 800 28.28 16 4.00

123 Sensibilità dellEsperimento NMR S/N N 5/2 B 0 3/2 N = Numero di spins che contribuiscono al segnale rapporto giromagnetico del nuclide studiato Camp magnetico utlizizzato

124 Alcuni dati da ricordare Tutti i nuclidi con I diverso da =0 possono essere studiati attraverso spettroscopia NMR I piu importanti, per lo studio di molecole d interesse biologico sono 1 H, 13 C, 15 N, 31 P Abbondanza naturale e la frequenza di risonanza sono importanti per determinare la sensibilità di un esperimento NMR 1 H è il nucleo piu studiato via NMR. PERCHE: i) la sua abbondanza isotopica è vicina al 100% ii) E il nucleo con la frequenza piu alta 13 C è il secondo nucleo piu studiato via NMR. PERCHE: i) la sua abbondanza isotopica è circa 1% ii) E un nucleo con la frequenza relativamente alta, (1/4 rispetto ad 1 H)

125 Typical 1 H NMR Spectrum Absorbance

126 Protein 1 H NMR spectrum: a real spectrum Fourier Transformation The NMR signal in the time domain Free Induction Decay A short pulse will excite all spins All spins will relax (all together) during time AQ The FT of FID gives the NMR spectrum

127 The NMR spectrometer Magnet Probe Coils Transmitters Amplifiers and pre-amplifiers Receiver ADC

128 The NMR spectrometer

129 The Magnet A cutted magnet History First magnets were built using ferromagnetic material= permanent magnet Then Electromagnets: i.e. field was generated by wiring of conducting material Now: cyomagnets: i.e. electromagnets made of superconducting wire.

130 Cryomagnets Superconducting wire has a resistance approximately equal to zero when it is cooled to a temperature close to absolute zero (-273.15o C or 0 K) by emersing it in liquid helium. Once current is caused to flow in the coil it will continue to flow for as long as the coil is kept at liquid helium temperatures. The length of superconducting wire in the magnet is typically several miles.

131 Magnet

132 The Probe The sample probe is the name given to that part of the spectrometer which accepts the sample, sends RF energy into the sample, and detects the signal emanating from the sample. It contains the RF coil, sample spinner, temperature controlling circuitry, and gradient coils. Picture an axial cross section of a cylindrical tube containing sample. In a very homogeneous Bo magnetic field this sample will yield a narrow spectrum

133 B 0 homogeneity In a more inhomogeneous field the sample will yield a broader spectrum due to the presence of lines from the parts of the sample experiencing different Bo magnetic fields.