Adriana Maggi METODOLOGIE DI IMAGING PER LO STUDIO DI

Presentazione sul tema: "Adriana Maggi METODOLOGIE DI IMAGING PER LO STUDIO DI"— Transcript della presentazione:

1 Adriana Maggi METODOLOGIE DI IMAGING PER LO STUDIO DI
EVENTI MOLECOLARI IN ORGANISMI VIVENTI

2 GENERAZIONE DI ANIMALI REPORTER Ingegneria Animale
animali mutati geneticamente ad esprimere un gene reporter

3 METODI DI INGEGNERIA ANIMALE
Iniezione di DNA esogeno nella cellula uovo (TRANSGENESI STANDARD) Ingegneria di cellule staminali in coltura e loro iniezione in blastocisti (GENE TARGETING)

4 TRANSGENESI STANDARD GENE TARGETING Microiniezione del DNA clonato
Trasfezione del DNA clonato in cellule ES zigote Embrione stadio 2 cellule Iniezione delle cellule staminali nella blastocisti Impianto della blastocisti in femmina pseudogravida Impianto nella femmina pseudogravida Topo chimerico 10-20% dei nascituri contiene il transgene Ibrido F1 25-75% della progenie portano il transgene

5 Preparazione costrutti Screening della progenie
‘pseudo pregnant’ Preparazione oociti fecondati microiniezione Preparazione costrutti Screening della progenie

6 Preparazione oociti fecondati
Cocktail ormonale Incrocio Recupero uova fecondate

7 Preparazione del costrutto
Purificazione del transgene propagazione del transgene transgene Vettore di clonaggio

8 Preparazione delle ‘pseudo pregnant’ Maschio vasectomizzato Femmina
Incrocio Impianto degli oociti microiniettati

9 Microiniezione e reimpianto degli oociti microiniettati
Prelievo delle uova fecondate Microiniezione Trasferimento delle uova fecondate microiniettate con il gene di interesse nell’utero di femmina pseudogravida

10 Screening della progenie
Analisi del DNA estratto dalle code della progenie per : Southern blot PCR

11 GENE TARGETING - procedura -
generazione di cellule staminali (Embryonic Stem cells o cellule ES) preparazione del vettore trasfezione delle cellule ES con il vettore iniezione delle cellule trasfettate nella blastocisti generazione di topi mosaico incroci successivi per ottenere l’animale con il transgene nella linea germinale

12 Generazione di cellule staminali ES
Femmine dopo 3-4 giorni dal concepimento Blastocisti Espianto e messa in coltura Crescita in terreno selettivo per le ES Disaggregazione 1 passaggio Linea pura

13 Trasfezione delle ES Trasfezione del vettore (elettroporazione)
Selezione delle cellule knock out Cellule ES

14 Strategia di selezione delle ES knock out
Destino del DNA Integrazione sito specifica Integrazione random Frequenza: Omologa/non omologa = 1/1000

15 Iniezione delle cellule ES nella blastocisti
- generazione di animali mosaico -

16 Incroci per l’omozigosi
Founder/wild type F1/F1 Omozigoti 1:4 Eterozigoti 1:2 Wild type 1:4 F2

17 THROUGH INTRACELLULAR
REPORTER SYSTEMS TO STUDY DRUGS ACTIVE THROUGH INTRACELLULAR RECEPTORS GFP POL II, TF, co-regulators ER Reporter ERE transcription Reporter: easily detectable protein REPORTER MOUSE

18 The ERE-Luc reporter mouse: a model
to study of ER transcriptional activity INSULATOR ( MAR ) light luciferin + ATP = oxyluciferin + AMP + TK ERE 2x firefly luciferase +/- ERE-Luc reporter mouse ERE kinase-dependent activation Ciana et al., 2001

19 5 min. after the acquisition
Evaluation of ER transcriptional activity 20 min. i.p. of D-luciferin 5 min. after the acquisition

20 dpc (day post conception)
ERE-Luc mouse 18.5 16.5 14.5 13.5 15.5 dpc (day post conception) ER is transcriptionally active at day 14.5 pc

21 ERE-Luc mouse GP Rando, 2007 P1 18.5 16.5 14.5 13.5 12.5
dpc (day post conception) post-natal day 1 endoderm mesoderm ectoderm imaging IHC A B C D E F G H C – intestine x D – bone x E – heart x F – forebrain x G – moustache 40x H – skin x 16.5 dpc GP Rando, 2007

22 ERE-Luc mouse Luciferase activity in adult, cycling females M D P E
bone 2 4 6 thymus 1 3 brain 5 10 15 20 P E M D2 intestine 8 12 16 LUCIFERASE ACTIVITY (RLU) D liver ovaries uterus 7 9 hypothalamus Luciferase activity in adult, cycling females M D P E /ml) 50 S ESTRUS pg 5 ( 40 4 E2 (pg/ml) 3 30 Estradiol 20 2 10 10 day 1 M day 2 D day3 P day 4 E Ciana et al, Nature Ned., 2003

23 ERE-Luc mice to understand ER involvement in mammals physiopathology
Pregnancy & Embryo Development 13.5 14.5 15.5 16.5 17.5 18.5 19.5 12.5 DAY 18.5 DAY 16.5 DAY 13.5 DAY 14.5 DAY 15.5 DAY 1 DAY 10 Immature Mice Adult Mice LIFE CYCLE Suckling Mice

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28 MOLECULAR IMAGING IN LIVING SMALL ANIMALS
Functional Magnetic Nuclear Resonance MicroPET Positron emission tomography Nuclear imaging Micro SPECT single-photon emission computerized tomography Optical imaging Bioluminescence Functional MRI: Pentylenetetrazol (PTZ) induced epileptic seizures were imaged with BOLD-sensitive gradient echo MRI (TE=20 ms). Multiple cortical areas, hippocampal, thalamic, and midbrain nuclei show different temporal changes in signal intensity. Top row: four images of the resting state prior to the injection. Middle row: putative kindling preceding seizure. Bottom row: full blown seizure. Image courtesy of Bruker Medical and C. Ferris, K.Lahti, D. Olson, & J. King. Psychiat. Dept, Univ. Massachusetts, Worcester, Mass. USA microCT - Mouse Skeleton Full skeleton of mouse body, lateral view. Image courtesy of ImTek, Inc. microPET: Species: Rat Type of Study: Whole Body Tracer: 18F-FDG Injected Dose: 2 mCi Imaging Time: 8 mins / bed position, 16 positions Comment: Whole body sections through rat showing 18F-FDG distribution. Notice prominent uptake in heart, brain and collection of FDG in the bladder. MicroSpect: Animation of a normal mouse scan Fluorescence: Skeletal metastases in mouse. Image courtesy of AntiCancer, Inc. Ultrasound:Sagittal section of whole mouse embryo. Image courtesy of VisualSonics Inc. and Foster and Zhang, Sunnybrook and Women's College. Ultrasound Fluorescence 2/06

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35 IN PHARMACOLOGICAL RESEARCH!
PARTICULARLY, IN PHARMACOLOGICAL RESEARCH! ONE PICTURE IS WORTH TEN THOUSAND WORDS (Frederic Barnhard 1927) 2/06