Corso di Laurea magistrale in Scienze Biologiche

Presentazione sul tema: "Corso di Laurea magistrale in Scienze Biologiche"— Transcript della presentazione:

1 Corso di Laurea magistrale in Scienze Biologiche
“Iperparatiroidismo normocalcemico nella popolazione italiana: studi sui meccanismi fisiopatologici” Relatore interno: Dott.ssa Paola Del Porto Candidata: Federica Ferrone Relatore esterno: Prof. Salvatore Minisola Corso di Laurea magistrale in Scienze Biologiche Curriculum Genetica e Biologia Molecolare nella Ricerca di Base e Biomedica

2 Iperparatiroidismo primitivo (IPP o pHPT)
È una malattia endocrina caratterizzata da secrezione di PTH in eccesso rispetto alle esigenze omeostatiche del calcio, con conseguente ipercalcemia Colpisce prevalentemente l’età adulta, con una maggiore frequenza nelle donne in menopausa (rapporto femmine-maschi è di 3:1) Può esistere sia nella forma sporadica (95% dei casi) che nelle forme ereditarie (< 5% dei casi) Clinicamente, si manifesta con osteoporosi, aumentato rischio di fratture vertebrali, nefrocalcinosi, litiasi renale ed altre manifestazioni cliniche correlate all’ipercalcemia (neuro-psicologiche, gastro-intestinali, cardio-vascolari e neuro-muscolari)

3 Modificazione nel tempo della presentazione clinica dell’IPP
Pazienti con sintomatologia clinica Dosaggio automatico della calcemia nella routine emato-chimica ospedaliera Richiesta maggiore di dosare i livelli di PTH nel sangue Forma plurisintomatica Forma asintomatica (più comune) Forma normocalcemica

4 Iperparatiroidismo primitivo normocalcemico (NPHPT)
In occasione del “Third International Workshop on the Management of Asymptomatic primary Hyperparathyroidism” nel 2008 NPHPT è stato definito come: PTH persistentemente elevato (almeno due misurazioni a distanza di 3-6 mesi) Calcio totale ed ionizzato nella norma Esclusione di cause secondarie di aumento di PTH

5 Cause note di iperparatiroidismo secondario
Commento Insufficienza vitamina D 25(OH)D plasmatica < 20 ng/mL Malattia renale cronica (MRC) Quando il tasso di filtrazione glomerulare (GFR) < 60 mL/min Farmaci Tiazidici (diuretici) e litio (trattamento disturbo bipolare) Ipercalciuria da perdita renale Ipercalciuria renale Disordini gastrointestinali associati al malassorbimento di calcio Morbo celiaco, fibrosi cistica Pseudoipoparatiroidismo tipo 1b Alcuni casi si possono presentare come normocalcemici

6 Studi epidemiologici sul NPHPT
Studio Popolazione Prevalenza Commenti Lundgren et al. 5202 donne svedesi post-menopausa di età anni 0,5% Non escluse cause secondarie di iperparatiroidismo Misra et al. 2370 donne e uomini americani di età > 45 anni (NHANES) 1% Escluse insufficienza renale (GFR < 60 mL/min) e carenza di vitamina D (< 30 ng/mL). No Ca2+ Berger et al. 1871 uomini e donne canadesi di età anni (CaMos) 16,7% Esclusa carenza di vitamina D (< 20 ng/mL). Garcia-Martin et al. 100 donne spagnole in post-menopausa 6% Escluse patologie renali, carenza di vitamina D (< 30 ng/mL) e malnutrizione. Prevalenza dell’iperparatiroidismo primitivo normocalcemico in varie popolazioni (Cusano NE et al., 2013)

7 Controllo ormonale dell’omeostasi del calcio e del fosforo
Complesso sistema omeostatico che agisce principalmente a livello renale, intestinale ed osseo 1,25(OH)2D PTH 25(OH)D Calcitonina

8 Controllo ormonale dell’omeostasi del calcio e del fosforo
CT

9 Controllo ormonale dell’omeostasi del calcio e del fosforo
Massima capacità secretoria di PTH Dà una misura della riserva di PTH che può essere secreta in caso di marcata ipocalcemia ed aumenta in caso di IPP Minima capacità secretoria di PTH Set-point Concentrazione di Ca2+ che determina una inibizione del 50% del rilascio di PTH Calcemia Stimolo secrezione PTH e formazione 1,25(OH)2D

10 Calcium-sensing receptor
CaSR Calcium-sensing receptor Glicoproteina di 1078 aa a 7 domini transmembrana appartenente alla famiglia dei recettori accoppiati alle proteine G È espresso in molti tipi cellulari (paratiroidi, tiroide, rene, osso, tessuto nervoso, ecc.), incluse le cellule paratiroidee, le cellule parafollicolari della tiroide e le cellule del tubulo prossimale renale Effetti: attivazione diretta della PLC ed inibizione dell’adenilato ciclasi (AC) → aumento produzione IP3, aumento mobilizzazione Ca2+ intracellulare, e riduzione secrezione PTH attivazione indiretta della PLA2 → leucotrieni —l secrezione PTH Gene CaSR (3q ) composto da 7 esoni ed altamente polimorfico

11 Parathyroid hormone 1 receptor o “classical” PTH receptor
Recettore a 7 domini transmembrana appartenente alla superfamiglia dei recettori di classe II accoppiati alle proteine G (GPCR) È espresso sugli osteoblasti e sulle cellule renali, ma anche su altri tessuti non coinvolti nell’omeostasi calcica (cartilagine, cute, placenta, muscolo liscio, mammella, e tessuto nervoso) Effetti: reclutamento della proteina Gαs (pathway di trasduzione del segnale classico) → attivazione adenilato ciclasi (AC) e PKA → aumento cAMP reclutamento della proteina Gαq/11 (pathway di trasduzione del segnale non classico) → attivazione PLC e PKC → aumento Ca2+ intracellulare Gene PTHR1 (3p22-p21.1) composto da 14 esoni ed altamente polimorfico

12 Laboratorio di Malattie Metaboliche dello Scheletro (Dip
Laboratorio di Malattie Metaboliche dello Scheletro (Dip. di Medicina Interna e Specialità Mediche dell’Ospedale Policlinico Umberto I di Roma): studio dell’epidemiologia del NPHPT dopo aver escluso tutte le possibili cause di aumento di PTH in presenza di normocalcemia controllo nel tempo delle modificazioni cliniche e biochimiche legate alla patologia

13 Scopo del lavoro Fornire nuovi strumenti sia per la valutazione della prevalenza del NPHPT in una popolazione sana di riferimento in Italia sia per la comprensione delle basi genetiche della patologia Obiettivo analisi genetica condotta nel laboratorio dell’Unità di Genetica Medica (Poliambulatorio “Giovanni Paolo II” dell’Ospedale Casa Sollievo della Sofferenza di San Giovanni Rotondo, Foggia): valutare la possibile relazione tra i polimorfismi del gene CaSR e del gene PTHR1, collegati al fenotipo della malattia, ed i soggetti volontari sani con valori di PTH al di sopra dei livelli normali (in assenza di ipercalcemia)

14 Risultati (1) Descrizione della popolazione selezionata per lo studio della prevalenza dell’iperparatiroidismo normocalcemico in Italia Popolazione di 2353 donatori di sangue (età compresa tra i 18 ed i 66 anni) proveniente dal Centro trasfusionale “Ad Spem” del Policlinico Umberto I di Roma (marzo 2014-luglio 2015)* 1730 623 1053 volontari sani (età media 40 ± 12): analisi completate 1300 volontari sani: analisi in corso 781 272 949 351 Determinazione dei valori ematici di Ca2+, PTH, 25(OH)D *Lo studio è stato regolarmente approvato dal Comitato Etico il 17 gennaio 2014 (Stato del lavoro aggiornato fino al 1 ottobre 2015)

15 In base alla concentrazione di Ca2+ sierico
Risultati (1) Determinazione quantitativa del Ca2+ mediante metodo iono-selettivo con l’analizzatore biochimico completamente automatizzato NOVA 8 (Nova Biomedical, Gepa) In base alla concentrazione di Ca2+ sierico 82 soggetti con valori di Ca2+ elevati (1,36 ± 0,03 mmol/L, range 1,18-1,33) 966 soggetti con valori di Ca2+ normali (1,27 ± 0,03 mmol/L, range 1,18-1,33) 5 soggetti con valori di Ca2+ ridotti (1,04 ± 0,12 mmol/L, range 1,18-1,33)

16 Risultati (1) 966 soggetti con valori di Ca2+ normali
Determinazione quantitativa degli ormoni calciotropi tramite immunodosaggio a chemiluminescenza (CLIA) con l’analizzatore completamente automatizzato LIAISON® (DiaSorin) 966 soggetti con valori di Ca2+ normali 113 individui con valori di PTH elevati (44,97 ± 8,31 pg/mL, range 6,5-36,8), in assenza di ipercalcemia 853 individui sono stati esclusi dallo studio 88 25

17 Risultati (1) 113 individui con valori di PTH elevati, in assenza di ipercalcemia In base alla concentrazione di 25(OH)D sierica 69 individui con valori di 25(OH)D < 20 ng/mL (12,98 ± 4,25 ng/mL, range ) 13 individui con valori di 25(OH)D normali (33,82 ± 4,4 ng/mL, range ) 100 individui con valori di 25(OH)D < 30 ng/mL (16,78 ± 6,71 ng/mL, range )

18 Risultati (2) Modificazione dei livelli di calcio ionizzato, PTH e 25(OH)D dopo supplementazione con colecalciferolo 113 soggetti con PTH aumentato in assenza di ipercalcemia Invitati ad effettuare visita ambulatoriale presso il Dip. di Medicina Interna e Specialità Mediche dell’Ospedale Policlinico Umberto I di Roma 59 individui non sono stati ristudiati 54 individui hanno effettuato la visita e la supplementazione con colecalciferolo U.I. settimanali per 4 settimane 37 soggetti sono risultati non rintracciabili 22 soggetti non si sono presentati

19 13 soggetti non sono tornati
Risultati (2) 54 individui ritornati a visita e sottoposti a supplementazione con colecalciferolo 41 soggetti sono tornati per esami biochimici ematici ed urinari (calcemia, magnesemia, PTH, vitamina D, Ca2+, fosforemia, creatinina, calciuria 24 h, clearance della creatinina 24 h, anticorpi IgA anti-transglutaminasi) 13 soggetti non sono tornati

20 Risultati (2) Modificazione dei livelli di PTH dopo supplementazione con colecalciferolo (p < 0,05) In 35 soggetti, il valore di PTH è ritornato nei limiti della norma dopo supplementazione con colecalciferolo (PTH pre-supplementazione 44,41 ± 8,7 pg/mL; PTH post-supplementazione 26,70 ± 10,5 pg/mL; p < 0,05), con persistenza di valori di calcemia nei limiti della norma (Ca2+ 1,26 ± 0,04 mmol/L sia pre- che post-supplementazione). Nei restanti 6 soggetti, i valori di PTH sono rimasti al di sopra dei livelli normali, in assenza di ipercalcemia.

21 Risultati (2) Modificazione dei livelli di 25-idrossivitamina D dopo supplementazione con colecalciferolo In 33 soggetti è stato osservato un aumento statisticamente significativo dei livelli medi di vitamina D [25(OH)D pre-supplementazione 19,34 ± 8,6 ng/mL; 25(OH)D post-supplementazione 37,5 ± 9,2 ng/mL; p < 0,05], permanendo in solo 2 a livelli al di sotto di 20 ng/mL ed in 6 tra 20 e 30 ng/mL.

22 Rapporto maschi/femmine 30/11 Ca2+ sierico (mmol/L) 1,26 ± 0,04
Risultati (2) Normocalcemici iperparatiroidei pre-supplementazione con colecalciferolo (n = 41) Normocalcemici iperparatiroidei post-supplementazione con colecalciferolo Età (anni) 48 ± 10 Rapporto maschi/femmine 30/11 Ca2+ sierico (mmol/L) 1,26 ± 0,04 PTH sierico (pg/mL) 44,41 ± 8,7 26,70 ± 10,5* 6 soggetti con valori > 36,8 pg/mL 25(OH)D (ng/mL) 19,34 ± 8,6 37,5 ± 9,2* 2 soggetti con valori < 20 ng/mL 6 soggetti con valori tra 20 e 30 ng/mL *T-value è 2, → p-value è 0, Il risultato è statisticamente significativo a p < 0,05 (test t di Student) *T-value è 2, → p-value è 0, Il risultato è statisticamente significativo a p < 0,05 (test t di Student)

23 Analisi genetica del CaSR e del PTHR1
Risultati (2) 41 soggetti sono tornati per esami biochimici ematici ed urinari dopo supplementazione con colecalciferolo 6 individui con PTH elevato e con calcio totale e ionizzato normali 35 individui con PTH normale 1 soggetto è risultato positivo agli Ab anti TTG 1 soggetto affetto da ipercalciuria renale (Ca/Cr ratio > 0,20) 5 soggetti sono risultati affetti da IPP normocalcemico (0,4% dei soggetti totali presi in esame) Analisi genetica del CaSR e del PTHR1

24 Screening dei polimorfismi del gene CaSR nei 5 pazienti NPHPT
Risultati (3) Screening dei polimorfismi del gene CaSR nei 5 pazienti NPHPT Analisi genetica del CaSR per sequenziamento Sanger tramite un processo di elettroforesi capillare completamente automatizzato con lo strumento Applied Biosystem® 3130xl Genetic Analyzer

25 Frequenza allelica nella popolazione europea in 1000 Genomi
Paziente SNP Frequenza allelica nella popolazione europea in 1000 Genomi Frequenza genotipica nella popolazione europea in 1000 Genomi Significato clinico (predisposizione) 1 rs IVS3+19G>A (variante intronica) eterozigote rs c.2956G>T/p.A986S (variante missenso) G: (37) A: (969) G: (860) T: (146) G|G: (1) A|G: (35) A|A: (467) G|G: (364) G|T: (132) T|T: (7) Ipercalcemia Ipocalciurica Familiare (FHH) (autosomica dominante) Elevati livelli di PTH intatto statisticamente significativi calcolosi renale (KSD) Elevati livelli di calcio sierico accoppiati ad elevata secrezione di calcio nelle urine Sviluppo di neoplasia delle paratiroidi nel sesso maschile rs c G>A C: (919) T: (87) C|C: (422) C|T: (75) T|T: (6) 2 rs IVS6+16T>C T: (865) C: (141) T|T: (368) C|T: (129) C|C: (6)

26 Frequenza allelica nella popolazione europea in 1000 Genomi
Paziente SNP Frequenza allelica nella popolazione europea in 1000 Genomi Frequenza genotipica nella popolazione europea in 1000 Genomi Significato clinico (predisposizione) 3 rs c.1631G>A/p.R544Q (variante missenso) eterozigote G: (1005) A: (1) G|G: (502) A|G: (1) Ipocalcemia Autosomica Dominante (ADH) e persistente ipocalcemia 4 rs IVS5+52G>A (variante intronica) rs c.2956G>T/p.A986S rs c.2968A>G/p.R990G G: (927) A: (79) G: (860) T: (146) A: (932) G: (74) G|G: (426) A|G: (75) A|A: (2) G|G: (364) G|T: (132) T|T: (7) A|A: (431) A|G: (70) G|G: (2) Ipercalcemia Ipocalciurica Familiare di tipo 1 (FHH di tipo 1) (autosomica dominante) Iperparatiroidismo Primitivo Grave Neonatale (NSHPT) (autosomica recessiva) Elevati livelli di PTH intatto statisticamente significativi calcolosi renale (KSD) Elevati livelli di calcio sierico accoppiati ad elevata secrezione di calcio nelle urine Sviluppo di neoplasia delle paratiroidi nel sesso maschile Ipercalciuria in pazienti con o senza 5 Nessun polimorfismo rilevato

27 Risultati (3) Guha M, Bankura B, Ghosh S, et al., Polymorphisms in CaSR and CLDN14 Genes Associated with Increased Risk of Kidney Stone Disease in Patients from the Eastern Part of India. PLoS One; 10(6): e Individui portatori allele T polimorfismo rs (A986S) (pazienti n°1, n°2 e n°4) → elevate concentrazioni di Ca2+ sierico → possibile azione inibitoria del CaSR sul riassorbimento tubulare del Ca2+ e sulla secrezione di PTH → aumento dei livelli plasmatici di Ca2+ accoppiati ad elevata escrezione di Ca2+; In studi in vitro, allele G polimorfismo rs (R990G) può dare gain of function del CaSR (paziente n°4) → sembra aumentare la sensibilità del CaSR al Ca2+ sierico → maggiore inibizione del riassorbimento renale di Ca2+ → pazienti con o senza Kidney Stone Disease (KSD) affetti da ipercalciuria renale; Individui portatori allele T (rs ) ed allele G (rs ) (paziente n°4) → maggiore rischio di sviluppare la KSD rispetto ad individui portatori allele T o allele G.

28 Risultati (3) Díaz-Soto G, Romero E, Castrillón JLP, Jauregui OI, de Luis Román D, Clinical Expression of Calcium Sensing Receptor Polymorphism (A986S) in Normocalcemic and Asymptomatic Hyperparathyroidism. Hormone and Metabolic Research; DOI: /s In pazienti NPHPT, allele T polimorfismo rs (A986S) (pazienti n°1, n°2 e n°4) è associato ad elevati livelli di PTH statisticamente significativi → polimorfismo rs (A986S) come possibile predittore indipendente dei livelli di PTH nei pazienti NPHPT, ma non nei pazienti IPP asintomatici

29 Risultati (3) Screening dei polimorfismi del gene PTHR1 nei 5 pazienti NPHPT SNPs selezionati dalla banca dati NCBI per il gene PTHR1 Effetto inattivante il PTHR1 rs (c.1176G>A esone codificante per V dominio TM) Variante Arg383Gln (R383Q) → mutazione inattivante la proteina PTHR1 → Condrodisplasia tipo Blomstrand (BOCD) (rara patologia autosomica recessiva) rs (porzione N-terminale) Variante Pro132Leu (P132L) → mutazione inattivante la proteina PTHR1 → BOCD rs (c.338 C>T) Formazione di un codone di stop prematuro nell’arginina in posizione 104 della proteina PTHR1 (Arg104Ter, R104X) → PTHR1 tronco → BOCD rs (c.1656C>T ultimo esone) Formazione di un codone di stop prematuro nell’arginina in posizione 485 della proteina PTHR1 (Arg485Ter, R485X) → PTHR1 tronco nella coda citoplasmatica → Sindrome di Eiken (rara patologia autosomica recessiva) Analisi genetica del PTHR1 per sequenziamento Sanger tramite un processo di elettroforesi capillare completamente automatizzato con lo strumento Applied Biosystem® 3130xl Genetic Analyzer Maruani G, Hertig A, Paillard M, Houillier P, Normocalcemic primary hyperparathyroidism: evidence for a generalized target-tissue resistance to parathyroid hormone. J. Clin. Endocrinol. Metab.; 88: 4641–8.

30 Sequenziamento per intero del gene PTHR1
Risultati (3) Tipizzazione genotipica degli SNPs scelti per il gene PTHR1 nei 5 pazienti NPHPT Esito negativo Esistono altri polimorfismi, o anche mutazioni, non ancora noti, sul gene PTHR1 che spieghino il fenotipo riscontrato in questi soggetti? Sequenziamento per intero del gene PTHR1

31 Prospettive future Studio funzionale in cellule HEK293 del polimorfismo rs (c.1631G>A in 6°esone → variazione non conservativa R544Q) Sequenziamento per intero del gene PTHR1 Tipizzazione genotipica degli SNPs del gene GNAS (codificante la proteina Gαs), e del gene GNA11 (codificante la proteina Gαq/11), entrambi coinvolti nella cascata di trasduzione del segnale a valle del PTHR1, mediante sequenziamento Sanger Analisi genetica degli SNPs del gene del PTH mediante sequenziamento Sanger Questi elevati livelli di PTH, in assenza di ipercalcemia, sono dovuti all’effetto di altri SNPs o, anche di mutazioni, su geni diversi da quelli del CaSR e del PTHR1?

32 Punti di forza del lavoro
Punti di forza e limiti Punti di forza del lavoro Limiti del lavoro Prevalenza del NPHPT è la più bassa presente in letteratura (0,4%) → rispetto a precedenti lavori, popolazione in esame finemente selezionata, escludendo tutte le cause secondarie di aumento di PTH e dosando Ca2+ e calcemia totale Popolazione di giovani adulti (781 uomini, 74% del totale; età media 40 ± 12) (IPP è tipico di donne in post-menopausa) Popolazione non proveniente da un Centro delle Malattie Metaboliche dell’Osso Tutti i partecipanti con ipovitaminosi D sono stati supplementati con colecalciferolo → livelli di vitamina D sufficienti Se si accetta l’ipotesi che il NPHPT sia la prima fase di un disordine bifasico che evolve nella forma ipercalcemica, l’età della nostra popolazione coinciderebbe con la fase iniziale di sviluppo della malattia

33 Conclusioni L’ipovitaminosi D è la principale causa di aumento dei livelli di PTH (88% dei 113 donatori hanno insufficienza vitaminica D), in assenza di ipercalcemia, nella popolazione studiata Prevalenza di NPHPT è 0,4%, in assenza di cause secondarie di aumento di PTH I 5 pazienti affetti da NPHPT non presentano, al momento, manifestazioni cliniche correlate all’iperfunzione paratiroidea → la maggior parte è risultata positiva ai polimorfismi del gene CaSR che predispongono ad ipercalcemia accoppiata o meno ad ipercalciuria, a formazione di calcoli renali, ad elevati livelli di PTH e/o a sviluppo di neoplasia delle paratiroidi nel sesso maschile Ipotesi del NPHPT come una forma prodromica dell’IPP asintomatico sia quella più plausibile

34 Desidero ringraziare Prof. Salvatore Minisola Dott.ssa Paola Del Porto
Dott. Vito Guarnieri Dott.sse Valeria Fassino, Vittoria Cammisotto e Federica Gargini Tutto il Dip. di Medicina Interna e Specialità Mediche (Policlinico Umberto I di Roma), tutto lo staff del Centro trasfusionale “Ad Spem” (Policlinico Umberto I di Roma), i 2353 donatori di sangue, tutto il team del laboratorio dell’Unità di Genetica Medica (Poliambulatorio “Giovanni Paolo II”, Ospedale Casa Sollievo della Sofferenza di San Giovanni Rotondo, Foggia) Federica Ferrone

35

36 Forma sporadica di IPP (95% dei casi)
Forme ereditarie di IPP (< 5%) Adenoma singolo (85% dei casi) o multiplo (4%) Iperplasia (10%) Carcinoma (1%) o, più raramente, cisti, lipoadenomi o lipoiperplasia MEN I (malattia autosomica dominante): mutazioni germinali inattivanti il gene oncosoppressore MEN I. MEN II A (malattia autosomica dominante): mutazioni germinali attivanti il proto-oncogene c-RET. Sindrome Iperparatiroidismo-Tumori Mascellari (malattia autosomica dominante): mutazioni germinali inattivanti il gene oncosoppressore HRPT2/CDC73. Iperparatiroidismo Primitivo Familiare Isolato (malattia autosomica dominante): non si riconosce una precisa causa genetica. Sindrome dell’Ipercalcemia Ipercalciurica Familiare (malattia autosomica dominante): mutazione germinale inattivante atipica a livello della coda intracitoplasmatica del CaSR. Ipercalcemia Ipocalciurica Familiare (malattia autosomica dominante): mutazioni germinali inattivanti il gene codificante il CaSR. Iperparatiroidismo Neonatale Grave (malattia autosomica recessiva): mutazione germinale inattivante il gene codificante il CaSR.

37 Sintomatologia clinica dell’IPP
Manifestazioni ossee Ridotta massa ossea (in particolare a livello del radio distale, del femore e della colonna lombare,) cisti ossee, fratture patologiche, dolore osseo, granulazione del cranio “a sale e pepe”, scomparsa della lamina dentaria, erosioni sub-periostali, specie a carico delle falangi Manifestazioni renali Calcolosi renale, ipofosforemia da ridotto riassorbimento tubulare di fosfati, lieve acidosi metabolica da perdita di bicarbonato, ipercalciuria da aumentato riassorbimento intestinale di calcio associato ad un incremento del riassorbimento osseo, rischio aumentato di insufficienza renale Manifestazioni neuromuscolari Astenia, maggiore affaticabilità muscolare ed ipotrofia muscolare Manifestazioni neuropsichiatriche Sonnolenza, depressione, anoressia, psicosi, ridotta interazione sociale, disfunzioni cognitive e, per ipercalcemie particolarmente severe, coma Manifestazioni gastroenteriche Ulcera peptica, pancreatite acuta, nausea e vomito, stipsi Manifestazioni cardiovascolari Ipertensione arteriosa, ispessimento dell’’intima-media carotidea, calcificazioni miocardiche e valvolari, ipertrofia ventricolare e disfunzione diastolica Manifestazioni metaboliche Insulino-resistenza, intolleranza glicidica, ipertrigliceridemia, riduzione dei livelli di colesterolo-HDL e iperuricemia

38 Ipotesi sull’origine del NPHPT
NPHPT come un’entità clinica distinta NPHPT come la prima fase di un disordine bifasico, che successivamente potrebbe manifestarsi come IPP ipercalcemico NPHPT come una fase precoce dell’iperparatiroidismo secondario (SHPT = condizione endocrino-metabolica in cui l’aumentata secrezione di PTH è dovuta a insufficienza renale cronica, carenza di vitamina D, sindrome da malassorbimento intestinale, pseudoiperparatiroidismo tipo 1b per difetto di risposta nel recettore del PTH, o terapia cronica con farmaci che possono influenzare i livelli di PTH o il metabolismo del calcio) non classico NPHPT come forma di resistenza degli organi bersaglio all’azione del PTH

39 Controllo ormonale dell’omeostasi del calcio e del fosforo

40 Ormoni calciotropi Paratormone (PTH) 25-idrossivitamina D [25(OH)D]
Peptide di 84 aa a singola catena (9,3 kDa) Secreto dalle paratiroidi in risposta ad una riduzione del calcio extracellulare Deriva da un precursore di 115 aminoacidi (pre-pro PTH) Parte biologicamente attiva situata nei 34 aminoacidi della porzione N-terminale (PTH 1-34) Osso (azione diretta) → attivazione del riassorbimento dell’osso (osteolisi) da parte degli osteoclasti → stimolazione del rilascio di calcio e di fosfato Rene (azione diretta) → aumento del riassorbimento tubulare di calcio → aumento dell’escrezione renale di fosfato → stimolazione dell’attività dell’enzima 1α-idrossilasi → sintesi 1,25(OH)2D Intestino [azione indiretta mediata da 1,25(OH)2D] → assorbimento intestinale di calcio e di fosfato introdotti con la dieta 25-idrossivitamina D [25(OH)D] Deriva dalla conversione epatica della vitamina D prodotta nella cute o assorbita dall’intestino Rene Ipocalcemia/ipofosfatemia/elevati livelli di PTH → sintesi 1,25(OH)2D (forma attiva)

41 Ormoni calciotropi 1,25-diidrossivitamina D [1,25(OH)2D]
Forma attiva della 25(OH)D sintetizzata a livello epatico Prodotta da cellule del tubulo prossimale renale ad opera dell’enzima 1α-idrossilasi Inibisce la sintesi del PTH Osso → aumento del rilascio di calcio e di fosfato (unitamente al PTH) Intestino → assorbimento intestinale di calcio e di fosfato introdotti con la dieta Calcitonina (CT) Ormone polipeptidico di 32 aa Prodotto da cellule C della tiroide in risposta ad un aumento dei livelli di calcio sierico Effetto opposto al PTH Osso (CT—CTR su osteoclasti) —l attività degli osteoclasti di riassorbimento osseo → stimolazione della deposizione di calcio nelle ossa Rene → aumento dell’escrezione renale di calcio e di fosfato —l attivazione della vitamina D —l assorbimento intestinale del calcio introdotto con la dieta

42 Lo stesso risultato è stato ottenuto nel paziente n°2
Tipizzazione genotipica dello SNP rs nel paziente n°1 mediante sequenziamento Sanger con primer reverse sequenza-specifica per l’esone 7d. Lo stesso risultato è stato ottenuto nel paziente n°2 Tipizzazione genotipica dello SNP rs nel paziente n°3 mediante sequenziamento Sanger con primer forward sequenza-specifica per l’esone 6 Tipizzazione genotipica degli SNPs rs e rs nel paziente n°4 mediante sequenziamento Sanger con primer reverse sequenza-specifica per l’esone 7d.

43 Risultati (1) 113 individui con valori di PTH elevati, in assenza di ipercalcemia In base alla concentrazione di 1,25(OH)2D sierica In base alla concentrazione di 25(OH)D sierica 69 individui con valori di 25(OH)D < 20 ng/mL (12,98 ± 4,25 ng/mL, range ) 13 individui con valori di 25(OH)D normali (33,82 ± 4,4 ng/mL, range ) 108 individui con valori di 1,25(OH)2D nella norma (50,7 ± 12,48 pg/mL, range 19,9-79,3) 5 individui con valori di 1,25(OH)2D superiori al range di normalità (87,9 ± 5,27 pg/mL, range 19,9-79,3) 100 individui con valori di 25(OH)D < 30 ng/mL (16,78 ± 6,71 ng/mL, range )

44 Risultati (3) Particolarmente interessanti
SNPs rs (introne 3) e rs (introne 5), individuati, rispettivamente, nei pazienti n°1 e n°4 → no studi che confermano esistenza di una correlazione genotipo-fenotipo tra questi polimorfismi e le patologie FHH di tipo 1 e NSHPT Particolarmente interessanti rs (c.1631G>A in 6°esone → variazione non conservativa R544Q) Pochi dati in letteratura e non consolidati sull’effetto di questo SNP sul funzionamento del CaSR in pazienti NPHPT o IPP: associato a casi di Ipocalcemia Autosomica Dominante (ADH) e di persistente ipocalcemia? Studio funzionale in cellule HEK293 rs (c.2968A> G in 7°esone → variazione non conservativa R990G) e rs (c.2956G>T in 7°esone → variazione non conservativa A986S) Sembrano confermare la seconda ipotesi sull’origine del NPHPT: forma iperparatiroidea normocalcemica come forma prodromica dell’IPP asintomatico Significatamente associati con Calcolosi Renale (Kidney Stone Disease KSD), con ipercalciuria in pazienti con o senza i calcoli renali, o con elevati livelli di PTH (Guha M et al., 2015; Díaz-Soto G et al., 2015)

45 Protocollo pre-amplificazione DNA templato
DNA in Low-TE (25 µg/ml) 2 µl Buffer con MgCl2 10x specifico per AmpliTaq Gold® polimerasi 2.5 µl dNTP mix a 2 mM Primers Forward specifico per la sequenza da amplificare a 10 µM 1 µl Reverse specifico per la stessa sequenza da amplificare a 10 µM H2O milli-Q sterile 15.7 µl AmpliTaq Gold® polimerasi a 5 U/μl (Applied Biosystems) 0.3 µl Vol. totale 25 µl

46 Primers forward e reverse specifici per gli esoni del CaSR
Esoni del gene CaSR Primer forward Primer reverse Esone 2 3'-CAATCTGTAGACATGTGTCCC-5' 5'-TGTGGGGGCAATAAGCTTCA-3' Esone 3 3'-AAACCCAGCTTTGCCAGGTCT-5' 5'-TAAACCGTATGGCTATTGGGC-3' Esone 4a 3'-GTTGATAAATGAGACCAAGGC-5' 5'-TCCTCATCAGAGTACTGGGA-3' Esone 4b 3'-TGCAGCTGATGACGACTATG-5' 5'-CCTTGGCAAAACCATTGTGG-3' Esone 4c 3'-ATTGGATTCGCTCTGAAGGCTG-5' 5'-TGGAGTTGCAGCCCAACTCT-3' Esone 5 3'-GGCACAGCCTACCTAATTAGT-5' 5'-TTGGAAGTCCAGTGGGGAAA-3' Esone 6 3'-AATGGGCCCAACGTCTGTCA-5' 5'-CCTTCCATGGGCTTCACTGA-3' Esone 7a 3'-TATGTAGTGACCACATCCA-5' 5'-TCACCAGGATGCATGAGATG-3' Esone 7b 3'-TGTTCTTCATCGGGGAGCCCCA-5' 5'-CTTCATTGAAGTTCTCCGGCAGC-3' Esone 7c 3'-CTTCCTGATCGGCTACACCTG-5' 5'-TCTTGCTGGGTTAGGGCCA-3' Esone 7d 3'-CGAAGACCCATTCCCACAG-5' 5'-CGGTCAGATCTAAGTCCGTT-3' Esone 7e 3'-CAGAAAAGCAGCGATACGCT-5' 5'-CTTCTTCCTCAGAGGAAAGG-3'

47 Primers forward e reverse specifici per i 4 polimorfismi del gene PTHR1 (R383Q, P132L, R104X, R485X)
SNPs del gene PTHR1 Primer forward Primer reverse R104X rs 3'-ATCCTGCACTCCCATTCCAA-5' 5'-ACACTCTGTCTTCTCCCAGC-3' P132L rs 3'-GAGCTGAGATCACGCCATTG-5' 5'-GGTAAGGTTGCTGGAGGAGT-3' R383Q rs 3'-GGAAAACCAAGGGCTCAAGG-5' 5'-ACACTCACAGACTCCAGCTC-3' R485X rs 3'-AGATTGGAGGACTCAGCCAC-5' 5'-TCAGAAGAGTTGGCCCAGAG-3'

48 denaturazione iniziale
N° cicli Temperatura Tempo Step 1 95°C 12 min denaturazione iniziale 35 30 s denaturazione 58-60°C annealing 72°C estensione 7 min estensione finale Prodotto di PCR 2.5 µl Enzima illustra™ ExoProStar™ (GE Healthcare Life Sciences) 1 μl Vol. totale 3.5 µl Mix di reazione incubata prima a 37°C per 15 min e poi ad 80°C per 15 min

49 denaturazione iniziale
Protocollo PCR reazione di sequenziamento dei geni CaSR e PTHR1 tramite metodo di Sanger Prodotto di PCR purificato 0.8 µl BigDye® Sequencing Buffer 5x 1 µl Primer forward o reverse specifico per il templato 0.3 µl H2O milli-Q sterile 7.4 µl BigDye® Direct Sequencing Master Mix 0.5 µl Vol. totale 10 µl Strumento Applied Biosystem® 3130xl Genetic Analyzer N° cicli Temperatura Tempo Step 1 96°C 1 min denaturazione iniziale 25 10 s denaturazione 50°C 5 s annealing 60°C 2 min estensione

50 Primers forward e reverse utilizzati nella reazione di sequenziamento del gene CaSR
Esoni del gene CaSR Primer forward Primer reverse Esone 2 3'-CAATCTGTAGACATGTGTCCC-5' Esone 3 3'-AAACCCAGCTTTGCCAGGTCT-5' 5'-TAAACCGTATGGCTATTGGGC-3' Esone 4a 3'-GTTGATAAATGAGACCAAGGC-5' Esone 4b 3'-TGCAGCTGATGACGACTATG-5' Esone 4c 3'-ATTGGATTCGCTCTGAAGGCTG-5' Esone 5 3'-GGCACAGCCTACCTAATTAGT-5' Esone 6 3'-AATGGGCCCAACGTCTGTCA-5' Esone 7a 3'-TATGTAGTGACCACATCCA-5' Esone 7b 3'-TGTTCTTCATCGGGGAGCCCCA-5' Esone 7c 3'-CTTCCTGATCGGCTACACCTG-5' Esone 7d 5'-CGGTCAGATCTAAGTCCGTT-3' Esone 7e 3'-CAGAAAAGCAGCGATACGCT-5'

51 Primers forward e reverse utilizzati nella reazione di sequenziamento del gene PTHR1
SNPs del gene PTHR1 Primer forward Primer reverse R104X rs 3'-ATCCTGCACTCCCATTCCAA-5' 5'-ACACTCTGTCTTCTCCCAGC-3' P132L rs 3'-GAGCTGAGATCACGCCATTG-5' 5'-GGTAAGGTTGCTGGAGGAGT-3' R383Q rs 3'-GGAAAACCAAGGGCTCAAGG-5' 5'-ACACTCACAGACTCCAGCTC-3' R485X rs 3'-AGATTGGAGGACTCAGCCAC-5' 5'-TCAGAAGAGTTGGCCCAGAG-3'

52 Purificazione dei prodotti di sequenziamento con metodo cromatografico, usando le colonnine DyeExe 2.0 SpinKit (Qiagen), seguendo le istruzioni del fornitore Prima di essere caricati nel sequenziatore, i frammenti purificati (1 μl di campione in ogni pozzetto della piastra) sono stati miscelati con formammide (10 μl di formammide in ogni pozzetto della piastra) su una piastra da 96 pozzetti, denaturati a 94°C per 3 min e posti in ghiaccio per impedire il riappaiamento dei filamenti Una volta applicata la differenza di potenziale (che varia tra 8.5 kV e 13.2 kV a seconda delle impostazioni del sequenziatore), inizia la corsa elettroforetica alla temperatura di 60°C La durata in media di una corsa elettroforetica è di min

53 Vignali E, Cetani F, Chiavistelli S, Meola A, Saponaro F, Centoni R, Cianferotti L, Marcocci C, Normocalcemic primary hyperparathyroidism: a survey in a small village of Southern Italy. Endocrine Connections; 4: 172–178. In questo studio sono stati valutati: storia clinica; assunzione di calcio giornaliera (questionario autogestito); densitometria del calcagno mediante l’utilizzo di ultrasuoni per valutare la quantità di calcio nelle ossa; calcemia totale corretta per l’albumina sierica; creatinina; PTH (LIAISON®, DiaSorin); 25(OH)D (RIA, DiaSorin). Non sono stati misurati il Ca2+ sierico e l’escrezione urinaria di calcio 24 h (calciuria 24 h). La prevalenza di NPHPT stimata in questo lavoro è di 3/685 soggetti (0,44%).