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Corso di Patologia Vegetale Molecolare Massimo Reverberi.

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Presentazione sul tema: "Corso di Patologia Vegetale Molecolare Massimo Reverberi."— Transcript della presentazione:

1 Corso di Patologia Vegetale Molecolare Massimo Reverberi

2 Organizzazione del corso Periodo 04 Nov– 31 Jan 5 crediti lezioni frontali e seminari 1 credito esercitazioni pratiche (4 giorni in laboratorio) Esame unico orale (date già online fino al 2016) Materiale didattico – slide in pdf caricate sul sito docente di biologia + articoli e review (ENG) fornite volta per volta dal docente

3 Organizzazione del corso Il programma prevede: –Studio delle reazioni della pianta all’interazione con patogeni Riconoscimento Modulazione ormonale della difesa Risposte sistemiche – Modalità di attacco dei principali fitopatogeni Virus Batteri Funghi Insetti – Seminari a tema su: Apoptosi nelle cellule eucariotiche Lotta biologica con microrganismi benefici Interazione pianta-insetti-funghi patogeni- microrganismi benefici Le ricadute della ricerca di base nelle applicazioni biotecnologiche Fare impresa con le biotecnologie – gli spin-off La bioinformatica come tool per capire i dati -omici

4 Il sistema immunitario delle piante Le piante rispondono alle infezioni usando un sistema immunitario innato a 2 rami Il primo ramo riconosce e risponde a molecole comuni a molte classi di microbi patogenici e non Il secondo risponde a fattori di virulenza del patogeno sia direttamente o attraverso i loro effetti sui bersagli dell’ospite Tutti i patogeni, usando strategie diverse, rilasciano nelle cellule dell’ospite degli “effettori” o fattori di virulenza capaci di aumentare le chance di successo nell’infezione

5 Il sistema immunitario delle piante Le piante a differenza degli animali mancano di cellule immunitarie mobili e di un sistema immunitario adattativo somatico Quindi “confidano” nell’immunità innata di ogni cellula e sui segnali sistemici che vengono inviati dai siti d’infezione L’immunità innata delle piante è “gestita” da due sistemi –Il primo usa un insieme di recettori di riconoscimento transmembrana (PRRs) che rispondono agli “slow evolving” PAMP o MAMP (pathogen-microbe associated molecular patterns) (es. la flagellina)‏ –Il secondo agisce principalmente all’intreno delle cellule usando le polimorfiche proteine NB-LRR (nucleotide binding-leucine rich repeat) prodotte dai geni R

6 Le proteine NB-LRR sono correlate con le proteine animali CATERPILLER/NOD/NLR e le ATPase STAND. Sono codificate da più di 125 geni in Arabidopsis e da circa 600 in riso Gli effettori di tutti i diversi patogeni (virus, batteri, funghi etc) sono riconosciuti da proteine NB-LRR e attivano simili risposte difensive La resistenza mediata dalle proteine NB-LRR è efficace contro i patogeni biotrofici o emibiotrofi ma non contro i necrotrofi Le risposte di difesa attivate dai geni R sono qualitativamente molto simili a quelle attivate dai patogeni virulenti durante l’infezione

7 Il modello zig-zag (zig..) a 4 fasi Nella fase 1 i PAMP o MAMP sono riconosciuti dalle PRR. Tale reazione induce l’immunità stimolata dai PAMP o PTI che può bloccare il tentativo di colonizzazione da parte del patogeno

8 Il modello zig-zag a 4 fasi Nella fase 2 i patogeni di successo impiegano degli effettori che interferiscono con la PTI Questa “interferenza” dà origine alla suscettibilità stimolata dagli effettori (ETS)‏

9 Il modello zig-zag a 4 fasi Nella fase 3 un dato effettore è riconosciuto da una delle proteine NB- LRR dando il via ad una reazione di immunità indotta dall’effettore (ETI)‏ Il riconoscimento è sia indiretto o tramite il legame (diretto) tra un recettore NB-LRR ed un effettore L’ETI è una accelerata ed amplificata risposta PTI il cui risultato è, generalmente, una resistenza alla malattia e una morte ipersensibile (HR) nel sito d’infezione

10 Il modello zig-zag a 4 fasi Nella fase 4 la selezione naturale porta il patogeno a sviluppare degli strumenti per “evitare” l’ETI cioè evitare il riconoscimento, mediante “camuffamento” o diversificazione del gene che codifica per l’effettore, oppure acquisendo degli effettori addizionali che reprimono l’ETI Ma, sempre la selezione naturale risulta nella generazione di nuove specificità R che consentono di stimolare nuovamente l’ETI

11 La resistenza non ospite (RNO) riveduta… Molte piante resistono alla maggior parte dei patogeni per questo vengono chiamate non- ospite La RNO può essere spiegata il almeno due modi: –Gli effettori del patogeno potrebbero essere inefficaci su un ospite potenzialmente nuovo ma divergente da un punto di vista evolutivo. Quindi non sarebbero in grado di reprimere la PTI –Alla luce della guard hypothesis uno o più effettori del potenziale patogeno potrebbero essere riconosciuti anche da uno degli NB-LRR di piante che non sono ospite e quindi scatenare allo stesso modo l’ETI

12 ..e corretta! La RNO in Arabidopsis verso un patogeno non proprio (Blumeria graminis f.sp. Hordei) viene effettuata mediante l’apposizione di nuovi strati di parete cellulare e attraverso la produzione di metaboliti secondari tossici per il patogeno nel sito di infezione ma non attraverso l’HR I mutanti pen (penetration) di Arabidopsis sono parzialmente compromessi in questo tipo di risposta difensiva perché non producono le proteine PEN1-3 PEN2 è una glucosil idrolasi perossisomiale e PEN3 codifica per una ABC transporter Queste 2 proteine sono entrambi coinvolte durante il tentativo di penetrazione da parte del patogeno probabilmente per mediare il rilascio polarizzato di una tossina nell’apoplasto

13 La PTI La PTI è la prima risposta attiva alla percezione del patogeno La PTI viene iniziata dopo il riconoscimento di strutture microbiche evolutivamente conservate da recettori superficiali delle cellule vegetali e la sua induzione è associata con il signalling MAP kinasico, l’induzione trascrizionale di geni responsive all’attacco patogenico, la produzione di ROS e la deposizione di callosio per rinforzare la parete cellulare nei siti d’infezione

14 I patogeni di successo reprimono la PTI A cosa servono gli effettori? –Alcuni possono avere un ruolo strutturale come ad es. nella matrice extraustoriale che si forme durante alcune infezioni fungine o di oomiceti –Altre possono promuovere un rilascio di nutrienti o la dispersione del patogeno –Molti sembrano contribuire attivamente alla repressione di una o più componenti della PTI o dell’ETI (alcuni eff. Influenzano sia l’una che l’altra)‏

15 Effettori di fitopatogeni

16 Effettori di virus fitopatogeni Uno dei meccanismi principali attraverso i quali le piante si difendono dai virus è l’RNA silencing che regola l’accumulo di molecole di RNA endogeno ed estraneo. Un potente stimolo per l’RNAs è la presenza di RNA a doppio filamento La maggior parte dei virus vegetali hanno genomi a RNA e strutture a doppio filamento secondarie o come intermedi replicativi possono stimolare il silenziamento dell’intero genoma virale prevenendo la diffusione sistemica dell’infezione I determinanti della virulenza virale, in pratica degli effettori virali, possono reprimere il silencing Differenti soppressori possono interferire con componenti unici del macchinario del silenziamento suggerendo che molti virus possono aver sviluppato questo sistema indipendentemente A loro volta le piante usano un meccanismo secondario di difesa per riconoscere e restringere i movimenti dei virus. Specifiche R proteins riconoscono dei componenti virali (soppressori di silencing o altre proteine)‏

17 Riconoscimento diretto ed indiretto degli effettori Gli effettori che consentono al patogeno di evitare la PTI sono riconosciuti dai prodotti di specifici geni di resistenza La maggior parte dei geni R codifica per proteine NB- LRR, ce ne sono 125 in Arabidopsis Basta che un effettore sia riconosciuto da una proteina R per far attivare la ETI L’effettore che viene riconosciuto è denominato come fattore Avr (di avirulenza)‏ La risposta ETI è in realtà una versione più veloce e forte della PTI che molto spesso culmina nell’HR L’HR è limitata al sito d’infezione e può ritardare la crescita di alcuni tipi di patogeno (biotrofi)‏

18 La proteine NB-LRR La più grande classe di geni di resistenza è rappresentata da una famiglia di proteine che contengono sempre un nucloetide binding domain (NB) e un dominio Leucine rich repeat (LRR)‏ Il motivo NB ha omologia con la regione NB dei regolatori di apoptosi come CED4 (Caenorhabdtis elegans) e Apaf-1 (uomo)‏ Il dominio LRR è costituito tipicamente da AA e si trovano in tutti gli organismi viventi. I domini LRR sono soggetti a selezione diversificante e grazie alla loro ipervariabilità governano la specificità di riconoscimento. Le NB-LRR si dividono in 2 categorie –CC (coiled coil)-NB-LRR –TIR (Toll-interleukin1-receptor)-NB- LRR

19 La proteine NB-LRR Una altra principale classe di R genes codifica per proteine extracellulari LRR (eLRR)‏ 3 sottoclassi di eLRR sono state classificate in base alla struttura dei loro domini –RLP (receptor like proteins):costituite da un dominio extracellulare LRR e uno transmembrana TM –RLK: LRR+TM+ un dominio kinasico citoplasmatico –PGIP (polygalacturonase inhibiting proteins): dominio LRR in parete Le eLRR meglio caratterizzate sono i fattori Cf che conferiscono al pomodoro resistenza contro C. fulvum

20 La proteine NB-LRR Una nuova classe di R genes codifica per proteine TIR-NB-LRR che contengono anche un peptide segnale di localizzazione nel nucleo e un dominio di attivazione trascrizionale WRKY come RRS1-R che conferisce resistenza a Ralstonia solanacearum Recentemente è stata trovata in riso una proteina R, Xa27, che non ha alcuna omologia con le altre classi di R proteins e che conferisce resistenza a X. Oryzae che esprime AvrXa27 Questa proteina si esprime esclusivamente nelle cellule vicine al sito d’infezione, fornendo il primo esempio di espressione differenziale a livello tissutale di una R protein

21 Evoluzione e selezione delle proteine R Diversi geni NB-LRR sono sottoposti a splicing alternativo, in tal modo si generano varianti che codificano per proteine similari ai geni R troncati presenti normalmente nel genoma Il gene TIR-NB-LRR di tabacco che riconosce il TMV altera la relativa abbondanza di varianti di splicing durante l’infezione virale Diverse R proteins agiscono in complessi multiproteici che mediano l‘interazione con gli effettori del patogeno e inducono il signalling difensivo L’evoluzione dei geni R potrebbe essere facilitata dalla formazione di cluster di geni R, questo permetterebbe un continuo scambio di sequenze attraverso un mispairing ricombinativo generando cosi un’elevata diversità aplotipica

22 Evoluzione e selezione delle proteine R Recenti evidenze suggeriscono che la ricombinazione nei cluster R viene incrementata in seguito a infezione patogenica suggerendo un meccanismo che induce una instabilità genomica temporanea in risposta e forti stress come l’attacco di un patogeno In assenza della pressione del patogeno, la ricombinazione e l’attività dei trasposoni nei clusters R è inibita presumibilmente attraverso una modificazione della cromatina In tal modo scambi di sequenze e quindi la loro omogenizzazione viene limitata, i paraloghi dei geni R sono diversificati per mutazioni puntiformi e i geni R funzionali e gli aplotipi vengono conservati

23 Evoluzione e selezione delle proteine R In seguito a stress biotico dovuto ad un patogeno che riesce ad evitare le difese dell’ospite, una riduzione della metilazione risulta in un incremento della ricombinazione che persiste per diverse generazioni facilitando eventi di rimodellazione cromosomica come la duplicazione/perdita di geni e la generazione di geni chimerici attraverso lo scambio di sequenze L’assenza di stress attraverso l’evoluzione di una resistenza funzionale o attraverso la separazione ecologica dal patogeno induce nuovamente la stabilità nel genoma Un pattern di metilazione differenziale in alcuni regioni del genoma anche in assenza di stress potrebbe consentire continui fenomeni di ricombinazione nei R clusters, generando in tal modo una riserva di sequenze che potrebbe codificare proteine NB-LRR pronte a rispondere a patogeni ancora non incontrati (universo idiotipico?)‏

24 Co-evoluzione dei geni R e dei complementari effettori patogenici L’efficacia dell’ETI seleziona delle varianti microbiche che possono evitare il riconoscimento di un particolare effettore mediato dalle proteine NB-LRR Quindi la sua frequenza allelica sarà influenzata, in pratica, dalla sua modalità d’azione L’alto livello di selezione diversificante presenti nei geni che codificano per gli effettori è probabilmente legata e selezionata dal meccanismo di riconoscimento effettuato dall’ospite I geni che codificano per gli effettori sono spesso associati ad elementi genetici mobili o ai telomeri L’ETI può essere quindi resa inefficace mediante una continua diversificazione degli effettori ma anche attraverso la comparsa di effettori capaci di reprimerla Ad esempio in P. syringae AvrPphC reprime l’ETI stimolata da AvrPphF agendo quindi da fattore di virulenza

25 L’arms race rispiegata… 1.Un patogeno possiede un gene codificante per un effettore (E1) riconosciuto dal prodotto di un allele raro R1 dell’ospite 2.Questo risulta nella selezione di R1 per l’aumento della sua frequenza allelica nella popolazione dell’ospite a questo punto il patogeno che esprime l’effettore E1 viene riconosciuto dall’ospite e la sua crescita inibita 3.I patogeni in cui E1 è mutato o “abbandonato” vengono selezionati dato che sono gli unici che riescono a crescere sull’ospite contenente R1 12 3

26 4.L’efficacia di R1 viene erosa (dato che E1 è in bassa frequenza) e dato che l’espressione di un pattern di difesa ha dei costi in termini di fitness, le piante che hanno R1 hanno una fitness ridotta Questa risulta in una ridotta frequenza di R1 nella popolazione. La popolazione del patogeno ancora contiene individui con E1 5.In assenza di R1, E1 conferisce un aumento di fitness al patogeno e la sua frequenza nella popolazione ricomincia a crescere 6.Questo porta a “riesumare” R1 e il ciclo riprende…

27 Regolazione delle proteine NB-LRR Le proteine NB-LRR sono mantenute in un folding “segnale competente” grazie a hsp90 o ad altre chaperonine Il dominio LRR agisce come regolatore negativo che previene un’attivazione inappropriata del dominio NB Questo suggerisce che almeno in parte le proteine R siano regolate negativamente L’attivazione di NB-LRR coinvolge dei cambiamenti conformazionali inter ed intra-molecolari che assomigliano ai cambiamenti che subisce il fattore Apaf-1 che attiva la PCD nelle cellule animali L’associazione del CC domain con NB richiede la presenza di un dominio NB funzionale anche se lo stato (attivo/inattivo) dello stesso dominio non influenza le interazioni proteina-proteina del dominio LRR Questo ci suggerisce che NB sia “solo” il controllore delle interazioni tra i domini strutturali delle R proteins

28 Attivazione delle proteine NB-LRR L’attivazione delle proteine NB-LRR risulta in un complesso cross-talk tra le diverse risposte di difesa verso i patogeni biotrofi o necrotrofi Questo tipo di specificità è mantenuto da un preciso bilancio tra l’acido salicilico (SA), segnale locale e sistemico contro i biotrofi, e una combinazione di acido jasmonico (JA) e di etilene (ET) il cui accumulo agisce come segnale per attivare la difesa contro i necrotrofi Mutanti di Arabidopsis difettivi nella biosintesi o nella ricezione di SA manifestano alterazioni sia della resistenza basale che di quella sistemica In particolare, molte proteine NB-LRR attivano in modo differenziale le risposte indotte dal SA o dai ROS a livello locale o sistemico

29 ..e disattivazione È stato dimostrato che RPM1 (NB-LRR) “scompare” durante l’infezione con batteri che rilasciano nella cellula AvrRpm1 o AvrB Questa degradazione avviene probabilmente attraverso il proteasoma Un ruolo per il proteasoma nel funzionamento delle NB- LRR è stato dimostrato attraverso la perdita di funzionalità della R protein N, in piante di tabacco silenziate per componenti del signalosoma COP9 COP9 è un regolatore chiave del funzionamento della pathway di degradazione delle proteine in tutte le cellule Se le piante degradano le R proteins in seguito ad attivazione è possibile che l’attivazione sia accoppiata alla degradazione delle proteina R per limitare la durata della loro attività come avviene in alcuni fattori di trascrizione umani

30 La chaperonina HSP90 citosolica è stata implicata anche nella distruzione proteasoma-mediata di proteine R Nelle cellule animali in assenza di HSP90 i recettori per gli steroidi non possono legare gli ormoni e sono degradati nel proteasoma. In presenza di HSP90 e di ormoni steroidei i recettori si attivano. In seguito all’attivazione però, questi recettori sono degradati attraverso il proteasoma. Facendo operare entrambi i sistemi (attivazione- degradazione) attraverso HSP90 la cellula ha un meccanismo che accoppia la formazione di un complesso funzionale recettore-ligando al meccanismo di degradazione Questo sistema fornisce un preciso meccanismo per limitare gli effetti di una attivazione spontanea dei recettori, che nel caso delle R proteins, risulta essere letale per la cellula stessa (molti fattori R controllano la PCD)‏

31 Meccanismo di attivazione/degradazione Come fa HSP90 a funzionare da link molecolare tra l’attivazione delle NB- LRR e la loro degradazione attraverso il proteasoma? Interagendo con RAR1 e SGT1 RAR1 è una gene comune nella resistenza a diverse razze di B. graminis nell’orzo che codifica per una piccola proteina che contiene due domini di legame con lo zinco Questo dominio di interazione proteina-proteina di 60AA è denominato CHORD (cysteine and histidine-rich domain (CHORD)- containing, zinc-binding protein 1) è comune a molte proteine animali coinvolte nel meccanismo di degradazione proteica

32 Meccanismo di attivazione/degradazione SGT1 che è una componente del complesso SCF (E3 ubiquitina ligasi – proteasoma) in Arabidopsis è richiesta per la resistenza contro almeno 4 isolati di Peronospora parasitica RAR1 e SGT1 interagiscono in vivo e funzionano da punti di convergenza in numerose pathway di resistenza alla malattia Quindi le proteine HSP90 –formano dei complessi contenenti R proteins mantenendoli in una conformazione attiva –mediano le interazioni tra queste e il proteasoma attraverso RAR1 e SGT1 Dopo l’attivazione della disease pathway l’HSP90 induce la degradazione della proteina NB-LRR mediante SGT1

33 Receptor oligomerization Il riconoscimento dell’effettore induce cambiamenti conformazionali nelle NB-LRR associati con uno scambio di nucleotidi nel dominio NB. Questo espone il dominio segnale N-terminale per attivare la risposta downstream La proteina NB-LRR «M» è accesa quando lega l’ATP e spenta con l’ADP Una volta attivate alcune proteine NB-LRR (vedi Flax L6) dovrebbe oligomerizzare i domini segnale per attivare le risposte downstream

34 Le proteine NB-LRR e la guard hypothesis Molte proteine NB-LRR riconoscono degli effettori di tipo III indirettamente determinando il prodotto della loro azione sui bersagli dell’ospite piuttosto che l’effettore stesso I principali punti della guard hypothesis sono: –Un effettore agendo come fattore di virulenza ha un suo target nell’ospite –Manipolando il suo bersaglio l’effettore contribuisce al successo del patogeno nello stabilire una reazione compatibile –La perturbazione che l’effettore provoca sul bersaglio- ospite genera un pattern molecolare pathogen- induced modified self in grado di attivare la corrispondente NB-LRR e di scatenare l’ETI

35 ..conseguenze Esistono 3 importanti conseguenze sperimentali questo modello: –Molteplici effettori possono essersi evoluti indipendentemente ma riuscire ad alterare gli stessi bersagli cellulari –Questo ha portato all’evoluzione di più di un fattore NB-LRR associato ad un target di più effettori (i.e. lo stesso NB-LRR per diversi effettori)‏ –Queste NB-LRR saranno quindi attivate dal riconoscimento di differenti modified self- patterns prodotti sullo stesso target dall’azione di diversi effettori

36 ..esempio 1 RPM1 di Arabidopsis è una proteina NB-LRR che si trova sul lato citosolico della membrana cellulare attivata dagli effettori AvrRpm1 e AvrB di P. syringae AvrRpm1 aumenta la virulenza di P. syringae in Arabidopsis cosi come AvrB in soia (G. max) AvrRpm1 e AvrB sono modificati da un sistema di acilazione eucariotico una volta rilasciati nella cellula dal sistema di secrezione di tipo III e quindi sono così indirizzati alla membrana cellulare Il loro target è RIN4 (una proteina di membrana acetilata) che viene fosforilato, inattivandosi. La sua fosforilazione attiva RPM1

37 ..esempio 2 RPS2 è una NB-LRR localizzata in membrana che è attivata da AvrRpt2 AvrRpt2 è una cisteina proteasi (eff. Tipo III) di P. syringae che possiede un sito di miristoilazione (dominio idrofobico) eucariotico che la indirizza verso la membrana dell’ospite AvrRpt2 è il terzo effettore che ha come target RIN4. Infatti questo fattore taglia RIN4, inattivandolo. Questo taglio porta all’ETI mediata da RPS2 In assenza di RPS2 AvrRpt2, svolgendo la sua azione idrolitica su RIN4 e altri fattori, contribuisce alla virulenza di P. syringae

38 ..esempio 3 RPS5 è una NB-LRR localizzata in membrana attivata da AvrRphB, una cisteina proteasi (eff. Tipo III) di P. syringae Questa possiede un sito di acilazione eucariotico che potrebbe indirizzarla verso la membrana AvrRphB taglia PBS1 una serina-treonina kinasi, inattivandola. Questo taglio porta all’ETI mediata da RPS5 L’attività catalitica di PBS1 tagliata è necessaria all’attivazione di RPS5, suggerendo che questo frammento di modified self mantenga la sua attività enzimatica come parte del meccanismo di attivazione di RPS5

39 ..esempio 4 Pto è una serina-treonina kinasi di pomodoro L’attività di Pto richiede la proteina NB-LRR Prf con cui forma un complesso molecolare Pto è il target di AvrPto e AvrPtoB (P. syringae) e quindi Prf controlla il corretto funzionamento di Pto, altrimenti scatena l’ETI

40 ..esempio 5 La proteina transmembrana RLP Cf-2 controlla l’attività della cisteina-proteasi Rcr3 in pomodoro Avr2 di Cladosporium fulvum codifica per un inibitore di cistein-proteasi (Rcr3) Quindi Cf2 dovrebbe controllare lo stato di Rc3 e attivare la difesa quando Rcr3 è inibito da Avr2

41 ..esempio 6 L’emibiotrofo Colletotrichum higginsianum produce una serie di effettori relativi a proteine che legano la chitina che pososno funzionare per inibire la PTI

42 The decoy model Tra i meccanismi indiretti di riconoscimento la pianta può usare delle proteine «esca» (decoy) evolute per mimare i target degli effettori La pianta quindi creerebbe dei falsi target «ad hoc» per «confondere» gli effettori L’evoluzione indipedente di «mimi» molecolari potrebbe risultare in un’esca esclusivamente coinvolta nella percezione dell’effettore

43 Vantaggi del modello «esca» Forze selettive contrarie operano sui target «bona fide» degli effettori (TE) In assenza della R protein i TE sono sotto pressione selettiva per ridurre l’interazione ed evadere la manipolazione da parte degli EF In presenza di una R protein il TE sarà invece sotto una pressione selettiva per favorire l’interazione con l’EF ed aumentare la percezione del patogeno La presenza di un decoy ridurrà la «costrizione» evolutiva imposta sul TE consentendogli (al decoy) di specializzarsi come corecettore che regola l’attivazione delle R protein

44 ..comunque Non tutti i fattori NB-LRR agiscono per riconoscimento indiretto, esistono almeno 2 esempi di interazione Avr/NB-LRR diretta: –RRS1-R, è una proteina che conferisce resistenza ai ceppi di Erwinia spp. che producono PopP2, un effettore che ha come bersaglio il nucleo della cellula ospite –Il locus L di lino codifica per una NB-LRR che interagisce con AvrL. Sia L che AvrL si trovano in arms race

45 ..dopo l’attivazione Ci sono almeno 3 vie che indipendentemente portano ad una riprogrammazione trascrizionale in seguito all’attivazione della difesa La prima è legata ai geni EDS1 (enhanced disease susceptibility) o PAD4 che interagiscono fisicamente tra loro in vivo EDS1/PAD4 interagiscono principalmente con le proteine CC- NB-LRR La riprogrammazione trascrizionale seguente al riconoscimento del patogeno è dipendente dall’accumulo a livello nucleare di EDS1

46 NDR1 La seconda è legata a NDR1 (non race specific disease resistance) che codifica per una glicosilfasfatidilinositolo(GPI) anchored protein Negli animali queste proteine si trovano nei rafts lipidici (specialised membrane domains enriched in certain lipids cholesterol and proteins ) e sono associate con complessi recettoriali. NDR1 interagisce principalmente con le proteine TIR-NB-LRR (ad es. interagisce con RIN4 e con RPM1)

47 RPW8 Una terza via è rappresentata dai geni R RPW8 1 e 2 che conferiscono resistenza a numerose powdery mildews (oidio) e codificano per delle proteine con domini CC ma senza le regioni NB e LRR

48 Ricapitolando…. Dopo la percezione dei PAMP del patogeno o dopo un interazione avr/R si depolarizza la membrana e si ha un efflusso di ioni Ca con attivazione di calmoduline/calmoduline kinasi e canali ionici di membrana Questi fattori contribuiscono all’attivazione della NADPHox (burst ossidativo) e di altre cascate MAP kinasiche nonché all’attivazione della NO sintasi Queste pathway contribuiscono indipendentemente o sinergicamente all’attivazione dei fattori EDS1/PAD4 o NDR1 Cosa controllano questi fattori? In primis la sintesi di acido salicilico, composto ormonale capace di attivare sia la resistenza locale che sistemica soprattutto contro i patogeni biotrofici L’SA è un potente induttore di risposta trascrizionale

49 Regolazione genica della difesa Un elemento chiave che controlla i cambiamenti di espressione genica indotti da SA durante la resistenza è NPR1 NPR1 è trasportata nel nucleo in risposta all’induzione della SAR e la sua localizzazione nucleare è necessaria per l’attivazione delle PR proteins NPR1 non sembra agire come un fattore di trascrizione ma ci sono molte evidenze di una sua interazione con dei fattori di trascrizione della famiglia TGA-bZIP Quindi NPR1 controllerebbe la trascrizione modulando l’attività dei fattori di trascrizione piuttosto che controllare direttamente l’espressione genica

50 I fattori WRKY In aggiunta ai fattori TGA-bZIP membri di una famiglia di fattori di trascrizione tipici delle piante, i fattori WRKY, agiscono sia a monte che a valle di NPR1, infatti l’espressione del gene che codifica per NPR1 stesso è controllata da questi fattori Mutazioni nei WRKY responsive elements nel promotore di NPR1 risultano in una riduzione della resistenza basale Comunque il ruolo a valle di NPR1 dei fattori WRKY è dimostrato dal fatto che molti geni responsive a NPR1 e più in generale attivati durante la SAR, posseggono nel loro promotore dei WRKY-RE Quindi un meccanismo generale della SAR mediata da NPR1 coinlvogerebbe dei fenomeni di derepressione genica da parte dei fattori WRKY combinata con l’attivazione genica operata dai TGA-bZIP

51 Regolazione dei fattori di trascrizione Una moltitudine di fattori di trascrizione sono espressi in risposta ad un’ampia varietà di differenti stimoli correlati alla difesa Membri delle famiglie geniche ERF(ethylene response factors), bZIP, Myb, WRKY cosi come altri fattori che presentano domini zinc finger sono up-regolati durante le interazioni compatibili ed incompatibili Tutti questi fattori di trascrizione che mostrano questa up-regolazione legata alla difesa si legano ai promotori dei molti geni PR o comunque correlati ad attività difensive e quindi possono partecipare alla loro regolazione D’altronde l’attività dei fattori di trascrizione può essere direttamente collegata con il signalling molto più a monte attraverso eventi di fosforilazione Sia i fattori ERF che WRKY possono essere target di protein kinasi attivate durante la difesa. Ad es. 3 ERF (Pti 4-5-6) vengono fosforilati da Pto, una serina/treonina kinasi, una R protein di promodoro che media il riconoscimento di P. syringae Il modulo MAPK stimolato da flg22 controlla l’espressione di WRKY29

52 Attivazione dei geni legati alla difesa I cambiamenti trascrizionali in almeno il 20% del genoma di Arabidopsis sono associati con la resistenza R-mediata e basale I pattern di espressione genica associati con una resistenza locale compatibile o incompatibile sono praticamente uguali Le risposte R-dipendenti però sono più rapide e uno specifico subset di geni sono indotti con maggiore intensità Quindi sottili differenze nel timing e nell’ampiezza dell’attivazione trascrizionale piuttosto che profonde modificazione del trascrittoma possono spiegare l’efficacia delle risposte R- mediate Esisterebbe quindi un meccanismo di funzionamento comune alla resistenza R-mediata e a quella basale che converte un segnale di input (il patogeno) in un output di espressione genica in un modo determinato da un punto di vista quantitativo

53 Biologia dell’invasione Myosina XI modula le risposte della cellula ospite e la resistenza alla penetrazione di patogeni fungini Il rimodellamento del citoscheletro di actina è pensato per contribuire alla creazione di barriere efficaci alla periferia delle cellule vegetali contro l'ingresso di funghi PENETRAZIONE 1 (PEN1) nelle papille apoplastiche, contribuisce all’attenuazione della resistenza alla penetrazione.


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