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Genetica dei Procarioti - 4 Dipartimento di Scienze della Vita CdS Biologia Molecolare e Cellulare (LM-6) Prof. Laura Marri ricevimento: previo appuntamento.

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1 Genetica dei Procarioti - 4 Dipartimento di Scienze della Vita CdS Biologia Molecolare e Cellulare (LM-6) Prof. Laura Marri ricevimento: previo appuntamento telefonico o A.A

2 Frequenza di mutazione La frequenza con cui avvengono i diversi tipi di mutazioni è estremamente variabile. Errori nella replicazione del DNA ricorrono con una frequenza di per coppia di basi per singolo ciclo di replicazione. Aumenta in fase stazionaria: mutazione di una cellula ogni 300–400

3 Una coltura di E. coli in terreno complesso (LB) entra in fase di morte dopo tre giorni di incubazione. In questa fase, il 90-99% della popolazione muore Una coltura di E. coli in terreno complesso (LB) entra in fase di morte dopo tre giorni di incubazione. In questa fase, il 90-99% della popolazione muore ossidazione di proteine e DNA, programma simile all’apoptosi eucariotica che determina la morte delle cellule al raggiungimento di una densità elevata

4 A partire dal 10° giorno delle colture in LB si osserva la comparsa, all’interno della popolazione batterica, del fenotipo GASP Le cellule sopravvissute possono utilizzare le sostanze rilasciate da quelle morte, inclusi gli amminoacidi dalle proteine, i lipidi dalla membrana cellulare e il DNA Dopo la fase di morte la vitalità delle cellule può essere mantenuta per mesi o addirittura per anni in una condizione definita fase stazionaria prolungata I fenotipi GASP mostrano una fitness migliore rispetto al ceppo parentale e il bilancio tra le cellule in crescita e morte fornisce un equilibrio dinamico il cui risultato finale è la vitalità stabile della popolazione

5 rpoS duplicazione di 46 bp all’estremità 3’  proteina in cui i quattro amminoacidi presenti a C-terminale sono sostituiti con 39 nuovi amminoacidi indebolimento dell’espressione del regulon (in E. coli RpoS controlla l’espressione di oltre il 10% dei geni) sbilanciamento della competizione tra i vari fattori sigma per il core della RNA polimerasi. Cellule con una ridotta espressione di rpoS favorirebbero, infatti, l’associazione dei fattori sigma RpoD (σ 70 ) e RpoN (σ 54 ) alla RNA polimerasi determinando una fitness migliore rispetto al ceppo wild-type

6 lrp Lrp è un regolatore trascrizionale che può funzionare sia da attivatore che da repressore e controlla l’espressione di molti geni implicati nel metabolismo e nel trasporto degli amminoacidi maggiore capacità di recuperare gli amminoacidi rilasciati dalle cellule morte, in particolare serina, treonina e alanina Attivazione operone ybeJ-gltJKL riarrangiamento genomico prodotto dalla sequenza di inserzione IS5. Quattro geni di questo operone sono implicati nella regolazione del trasporto per l’aspartato e il glutammato, aumenta il potenziale di assorbimento degli amminoacidi per i mutanti

7 mutanti GASP: “truffatori evolutivi”, ignorano i segnali di inibizione della crescita e continuano a moltiplicarsi Un modello delle basi fisiologiche del fenotipo GASP

8 La competizione osservata all’interno di popolazioni batteriche è stata interpretata facendo riferimento alla “teoria dei giochi” i “cooperatori” (WT-WT) coesistono, entrambi bloccano anticipatamente la crescita e sono premiati attraverso la redistribuzione delle risorse necessarie al mantenimento della popolazione per lungo tempo i “cooperatori” (WT) che incontrano i “truffatori” (GASP) sono imbrogliati e le loro risorse vengono consumate prematuramente dai secondi i “truffatori” che coesistono tra loro (GASP & GASP) sono puniti poichè continuano a crescere senza controllo mettendo a rischio la vitalità a lungo termine

9 in un habitat artificiale spazialmente strutturato (micro lastre in silicone) in cui la disponibilità dei nutrienti è omogenea, WT e GASP coesistono

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11 operone criptico sequenze di DNA fenotipicamente silenti normalmente non espresse durante il ciclo vitale dell’organismo Sistemi criptici in Escherichia coli K12 bgl metabolismo arbutina e salicina cel metabolismo arbutina, salicina, cellobiosio arbT assunzione arbutina asc metabolismo arbutina, salicina, cellobiosio

12 ARBUTIN SALICIN PHLORIZIN utilizzo beta-glucosidi aromatici operone criptico Bgl

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14 Operone bgl * *

15 bglG regione ATCAP P bgl t1t CF RNA polimerasi CAP-cAMP H-NS binds to the upstream regulatory element and the promoter

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17 StpA paralogo di H-NS The H-NS paralog StpA shares 58% amino acid identity with H-NS and the two proteins have many common properties. StpA can complement the gene expression defect of the hns single mutant (Shi and Bennet, 1994)

18 Antagonistic control of the Escherichia coli bgl promoter by FIS and CAP in vitro Caramel A, Schnetz K. Molecular Microbiology Volume 36, Issue 1, pages 85-92, 2002

19 293, (22 October 1981) Insertion of DNA activates the cryptic bgl operon in E. coli K12 Ann E. Reynolds, Jeffrey Felton * & Andrew Wright Spontaneous mutations which activate the cryptic bgl operon of Escherichia coli K12 are caused by insertion of DNA at a site, bglR, within the operon. Two insertion elements, IS1 and IS5, have been observed to effect this activation. Once the activating insertion has occurred the operon is inducible by glucosides in a cyclic AMP-dependent manner.

20 Sequence of the bgl promoter and upstream regulatory region. Indicated are the −35, −10, and transcription start sites of the promoter; the CRP binding site (boxed); and the Fis binding sites (dotted lines), as well as the BglJ-RcsB (solid lines) binding sites.

21 Promoters (P) are indicated by pointed flags. LeuO, a transcriptional regulator, likewise binds to the bgl upstream regulatory region and relieves repression of bgl independently of BglJ-RcsB. BglJ and RcsB (both TR of the LuxR-type family) interact and form heterodimers that presumably bind upstream of the bgl promoter

22 Operone bgl * *

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26 Ruolo biologico ed evolutivo dei geni criptici Secondo il modello di Hall et al. (1987), un gene di una popolazione microbica può trovarsi in tre stati: 1.Allele funzionale; 2.allele criptico; 3.allele non-funzionale. L’allele wild type è favorevole in certi ambienti, mentre in ambienti alternativi, con risorse limitate, l’allele criptico è vantaggioso.

27 La distribuzione di alleli criptici/funzionali per il metabolismo di β- glucosidi varia all’interno delle Enterobacteriacae in relazione alla nicchia ecologica occupata Klebsiella spp. Gruppo Ifermentano β-glucosidi aromatici e cellobiosio Escherichia coli, Shigella sonnei Gruppo II non possono fermentare β-glucosidi, ma possono mutare acquisendo indipendentemente un fenotipo Arb +, Sal + o Cel + Il mantenimento di alcuni sistemi criptici rappresenta un sistema di regolazione a lungo termine per funzioni raramente utilizzate In ambienti multi-risorsa, un allele criptico attivato è svantaggioso, ma selettivamente favorevole in particolari condizioni di stress (es. digiuno, risposta immunitaria dell’ospite)

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29 Nome/GeneFunzione σ 70 (rpoD) Geni necessari durante la crescita esponenziale σ 54 (rpoN) Geni espressi in condizioni di carenza di azoto σ 38 (rpoS) Geni espressi durante la fase stazionaria e in condizioni di stress generale σ 32 (rpoH) Geni espressi durante heat-shock (chaperoni per ristabilire il folding corretto delle proteine citoplasmatiche) σ 28 (rpoF) Geni codificanti per proteine coinvolte nell’assemblaggio del flagello σ 24 (rpoE) Geni espressi in condizioni di stress termico per ripristinare l’integrità di membrana e assicurare il folding corretto delle proteine di membrana σ 19 (fecI) Geni espressi in relazione al trasporto del citrato ferrico

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31 Consensus E. coli  32 (rpoH)

32 Some sigma factors are always expressed but inactive without a coactivator Some are only expressed when the genes they regulate are required Some are expressed but degraded Some are expressed but inactive due to anti-sigma factors

33 NomeFunzione σ 70 (RpoD) principale fattore durante la crescita in condizioni normali σ 54 (RpoN) assimilazione dell’azoto σ 38 (RpoS) principale fattore durante la fase stazionaria; affamamento σ 32 (RpoH) risposta a heat-shock σ 28 (RpoF) sintesi del flagello σ 24 (RpoE) EC σ 19 (FecI) trasporto del ferro

34 Anti-sigma Factors  Anti-sigma factors tightly (yet reversibly) bind sigma factors and prevent their activity. Anti- 

35 FlgM

36 durante le fasi iniziali della biogenesi flagellare σ 28 è mantenuto inattivo dalla stretta associazione con FlgM

37 l’uncino ed il corpo basale sono assemblati FlgM viene secreto attraverso il sistema di trasporto flagellare (T3S) folded form

38 The coupling of flagellar gene regulation to flagellum assembly. Chevance F F V et al. J. Bacteriol. 2006;188:

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40 Some sigma factors are always expressed but inactive without a coactivator Some are only expressed when the genes they regulate are required Some are expressed but degraded Some are expressed but inactive due to anti-sigma factors

41 NomeFunzione σ 70 (RpoD) principale fattore durante la crescita in condizioni normali σ 54 (RpoN) assimilazione dell’azoto σ 38 (RpoS) principale fattore durante la fase stazionaria; affamamento σ 32 (RpoH) risposta a heat-shock σ 28 (RpoF) sintesi del flagello σ 24 (RpoE) EC σ 19 (FecI) trasporto del ferro

42 ll sito di legame al ribosoma (RBS) dell'mRNA rpoS è appaiato alla regione 5‘ non tradotta dell'mRNA. Alcuni sRNA legandosì al 5' dell'mRNA impediscono la formazione della struttura secondaria e permettono la traduzione di RpoS (σ s ).

43 Most RpoS expression is determined at the translational level At least three different small RNAs, DsrA, RprA and OxyS, regulate RpoS translation the abundance and, therefore, the activity of each is in turn regulated by different environmental cues.

44 The stress response sigma factor RpoS has ~500 genes under its control Default situation: «off», the 5’ folds back to block the chromosome entry

45 Hfq consists of six identical subunits arranged in a ring shape structure Hfq is an RNA-binding protein encoded in approximately half of the (in 2002) sequenced bacterial genomes and is one of the most abundant proteins in E. coli.

46 The sRNA binds to the Hfq protein and then finds its target mRNA The typical action of an Hfq-associated sRNA.

47 regolazione mediante fattori sigma alternativi

48  sRNA (small RNA), possono svolgere la loro azione regolativa appaiandosi a regioni specifiche di un RNA bersaglio perfettamente o parzialmente complementare (sRNA antisenso)  Gli RNA antisenso sono molecole piccole (da poche decine a poche centinaia di nucleotidi), diffusibili

49 OmpF pori grandi OmpC pori piccoli in alternativa livelli di osmolarità

50 OmpCMicF

51 EnvZ/OmpR System of E. coli Senses changes in extracellular osmolarity

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