La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

La presentazione è in caricamento. Aspetta per favore

Lezione 4 Le costanti di accoppiamento Il rilassamento Accoppiamento dipolare.

Presentazioni simili


Presentazione sul tema: "Lezione 4 Le costanti di accoppiamento Il rilassamento Accoppiamento dipolare."— Transcript della presentazione:

1 Lezione 4 Le costanti di accoppiamento Il rilassamento Accoppiamento dipolare

2 A differenza dell’accoppiamento scalare, l’accoppiamento dipolare altera la popolazione dei livelli del sistema e non i valori di energia Da un punto di vista fisico, é l’accoppiamento tra due “magneti” che sono vicino nello spazio

3 Accoppiamento dipolare L’accoppiamento dipolare si ha tra due spin che sono vicini nello spazio Si tratta della interazione tra due dipoli magnetici, tra i quali, quando essi sono vicini nello spazio, si ha uno scambio di energia L’entità dell’effetto dipende dal campo magnetico e dalle dimensioni della molecola. Nel caso di spin 1H, l’accoppiamento dipolare si trasferisce per spin che si trovano a distanze inferiori ai 5 A. NON si osservano doppietti L’accoppiamento dipolare da luogo ad un trasferimento di magnetizzazione da uno spin all’altro. Questo effetto va sotto il nome di effetto NOE Nuclear Overhauser Effect Perturbo A Aumenta la intensità di B

4 Accoppiamento dipolare L’accoppiamento dipolare è “indipendente dall’accoppiamento scalare 2 spin possono essere accoppiati : -Scalarmente E dipolarmente se sono vicini nello spazio e legati da legami chimici -scalarmente ma non dipolarmente se sono legati da legami chimici ma non vicini nello spazio -dipolarmente ma non scalarmente se sono spazialmente vicini ma non legati da legamei chimici Pensate a degli esempi, per favore L’effetto NOE è osservabile in un esperimento NMR bidimensionale, detto NOESY (in realtà si puo’ anche osservare in esperimenti monodimensionle (1D NOE) di cui pero’ non parleremo

5 Distance constraints NOESY volumes are proportional to the sixth power of the interproton distance and to the correlation time for the dipolar coupling B0B0B0B0  IIII JJJJ r

6 Accoppiamento scalare ed accoppiamento dipolare L’accoppiamento scalare è l’accoppiamento tra spin nucleari che avviene tra atomi che sono legati da legami chimici (THROUGH BOND) E’ l’accoppiamento tra spin determinato dagli orbitali molecolari, ovvero le energie dei livelli di spin nucleari sono interdipendenti Porta alla formazione di doppietti e multipletti. Puo’ essere sfruttato per trasferire magnetizzazione da uno spin ad un altro, sfruttando il trasferimento atraverso legami chimici L’accoppiamento dipolare è l’accoppiamento tra spin nucleari che avviene tra atomi che sono vicini nella spazio (THROUGH SPACE) E’ l’accoppiamento tra due dipoli magnetici che sono vicini tra di loro Puo’ essere sfruttato per trasferire magnetizzazione da uno spin ad un altro, in funzione della loro prossimità spaziale

7 Through space AND throuhg bonds Through space Through bond

8 1D experiment Could be nice but.....Too crowded.. What do we learn? Chemical shifts relaxation rates Not enough to get a structure

9 The need for multidimensional NMR

10

11 Cosa è un esperimento bidimensionale ? Dopo un impulsi il segnale è pronto per essere acquisito Facciamo l’acquisizione ma NON terminiamo l’esperimento ed applichiamo ancora uno o piu’ impulsi in modo da perturbare ulterioremente il sistema Attraverso una combinazione di impulsi e delays noi facciamo in modo che ci sia uno scambio di magnetizzazione tra spin accoppiati SUCCESSIVAMENTE, acquisiamo il segnale una seconda volta

12 A 2D! An FID is a series of data points, each data point being separated by a sampling time (dwell time) A computer will consider an FID as a one dimensional array of data points.Each point has a different intensity F(t) We will now repeat the experiment a second time, just changing another delay previous to acquisition. F(t 2 ) F(t 1 ) 33 F(t) 33 3  3  3  n  0, ,2 ,3 ,4  …….…n  3+3+ 3  +2  3  +3  We repeat the same experiment n times We obtain a two dimensional array of data points in which rows and columns represent INDEPENDENT TIME DOMAINS. EACH POINT will be a function of both t1 and t2 The overall signal is an F(t1,t2) We collect a second F(t) which will be identical but for such delay. We store it in this way.

13 Fourier transformation F(t 1,t 2 ) F( 1,t 2 ) F(t 1, 2 ) F( 1, 2 ) Fourier transformation (t1) Fourier transformation (t2)

14 Acquisisco (t1)- Perturbo (trasferisco)- Acquisisco (t2) Se la perturbazione non ha effetto e se non c’è trasferimento di alcun tipo, Io ottengo lo stesso spettro in ciascuna delle 2 dimensioni tempo (t1 e t2) Dopo la trasformate di Fourier io otterro’ uno spettro dove i segnali appaiono su una diagonale di una matrice quadrata

15 Se durante la perturbazione una parte della magnetizzazione si traferisce da un nucleo ad un altro, per esempio per effetto di accoppiamento scalare, allora lo spettro della dimensione t2 sarà diverso da quello della dimensione t1. Il risultato è che avro’ dei segnali fuori dalla diagonale. Ciascun segnale fuori dalla diagonale darà la informazione sugli accoppiamenti scalari attivi nel sistema M (  I t 1 ) (  S t 2 ) Acquisisco (t1)- Perturbo (trasferisco)- Acquisisco (t2)

16 EXAMPLE N H H C C O We make a 1H experiment and we acquire. Then all signals transfer the information because of scalar coupling N H H C Then I observe Hc I observe Hn I consider the first and the second acquisition as two indpendent dimensions Spectrum after The J coupling Spectrum before The J coupling

17 EXAMPLE N H H C C O N H H C Spectrum after The J coupling Spectrum before The J coupling 4 ppm9 ppm Signal! This indicates that there is a scalar coupling between Hn and Hc

18 EXAMPLE N H H C C O N H H C Spectrum after The J coupling Spectrum before The J coupling 4 ppm9 ppm Signal! This indicates that there is a scalar coupling between Hn and Hc Hn Hc J-coupling

19 EXAMPLE N H H C C O Spectrum after The J coupling Spectrum before The J coupling Hc Hn J-coupling If you begin from Hc, the situation is the same !

20 EXAMPLE N H H C C O Spectrum after The J coupling Spectrum before The J coupling Hc Hn J-coupling Therefore, if I consider only this system Hn Hc J-coupling

21 The first dimension = t 1 The second dimension = t 2 the series of pulses that I have to apply to my system = PULSE SEQUENCE example t1t1 t2t2 t 1 dimension Or F1 t 2 dimension Or F2

22 Usually t 1 is also defined as indirect dimension t 2 is also defined as direct dimension the series of pulses that I have to apply to my system = PULSE SEQUENCE example t1t1 t2t2 t 1 dimension Or F1 t 2 dimension Or F2

23 F1 F2 Definitions Cross peak Two different frequencies are observed in the two dimensions Diagonal peak The same frequency is observed in both dimensions CROSS PEAK= Yes, There is a COUPLING between the two frequencies

24 Accoppiamento scalare L’accoppiamento scalare puo’ comunque essere osservato attraverso esperimenti NMR bidimensionali, quali il COSY

25 Example: COSY Through-bond connectivities COSY= COrrelation SpectroscopY H4-H5 H4’-H5’

26 Example: COSY Through-bond connectivities COSY= COrrelation SpectroscopY H4-H5 H4’-H5’

27 Beyond COSY COSY is not the only 2D experiment It is possible to transfer the information from spin A to spin B via several possible mechanisms The most important routes, which is COMPLEMENTARY TO J-coupling Is THROUGH SPACE COUPLING

28 The “old times” approachNOESY COSY Identify through space connectivities HN(i)-Ha(i) and HN(i)Ha(i-1) Identify through bond connectivities HN(i)-Ha(i) NOESY conn. COSY conn

29 Through space AND throuhg bonds Through space Through bond

30 Troppi segnali 1 H ?

31 Isotope labeling For biomolecules, tipically, 15 N or 13 C and 15 N, or 13 C, 15 N, 2 H 15 N Only A more effective fingerprint -characterization -folding -dynamics protein size >10000 Homonuclear 2D experiments do not have enough resolution HSQC or HMQC HSQC-NOESY or HSQC TOCSY

32 Isotope labeling For biomolecules, tipically, 15 N or 13 C and 15 N, or 13 C, 15 N, 2 H 15 N and 13 C Scalar couplings through 13 C atoms -triple resonance -assignment -structure protein size >20000

33 1 J couplings for backbone resonances

34 The HSQC experiment

35 Heteronuclear cases The scheme of 1J scalar couplings

36 Heteronuclear NMR OBSERVE 13 C during t 1 Transfer the information to all 1 H coupled Observe 1 H during t 2 1H1H 13 C No more diagonal Each peak indicate A differen H-C pair

37 Heteronuclear NMR OBSERVE 13 C during t 1 Transfer the information to all 1 H coupled Observe 1 H during t 2 1H 13C No more diagonal Two protons are bound to the same carbon CH 2

38 The HSQC experiment

39 In 5 minutes you may know…. if your protein is properly folded if all aminoacids gives rise to an observable peak Each amide NH group gives rise to one peak Detect H-N couplings Same sensitivity of a 1 H experiment (although you are observing 15 N) but much larger resolution if you can do the job (whatever is your job)

40 STRUTTURE IN SOLUZIONE VIA NMR

41

42

43

44

45

46

47

48

49

50

51

52

53

54

55

56 Cyt c oxidizedCyt c reduced Banci, Bertini, Bren, Gray, Sompornpisut, Turano, Biochemistry, 1997 Baistrocchi, Banci, Bertini, Turano, Bren, Gray, Biochemistry, 1996 Solution structure of oxidized and reduced Cytochrome c

57 Active site channel of Reduced Monomeric Q133 Copper Zinc Superoxide dismutase Reduced Q133M2SOD Reduced Q133M2SOD Oxidized human SOD Oxidized human SOD

58 Paramagnetic structure Diamagnetic structure RMSD backbone Residue Number Bertini, Donaire, Jiménez, Luchinat, Parigi, Piccioli, Poggi, J.Biomol. NMR, 2001,21,85-98 Structure of Ce 3+ substituted Calbindin D 9k

59

60 The HSQC experiment In 5 minutes you may know…. if your protein is properly folded if all aminoacids gives rise to an observable peak Each amide NH group gives rise to one peak Detect H-N couplings Same sensitivity of a 1 H experiment (although you are observing 15 N) but much larger resolution if you can do the job (whatever is your job)

61 Screening in silico + NMR Identificazioni dei siti di interazione: Analisi delle superfici in silico Analisi delle superfici via NMR (HSQC)

62 15 N HSQC del CytC con Cloroamina T ppm

63 Ca 2+ Apo 3.3 M GdmCl Loss of secondary structure elements: unfolded protein Refolding Ca M GdmCl The role of metal cofactor in protein unfolding Metal triggered protein folding

64 Structure-Activity Relationship by NMR

65 Screening via NMR Libreria di ProtEra 14 serie da 26 composti Proteina standard CytC da lievito Via Water LOGSY è stata analizzata l’interazione del CytC con 3 serie di composti (78) NMR time per inibitore: 45’x 2 Conc. del CytC non marcato: 8  M Conc. dell’inibitore: 800  M Dall’analisi risultano interagire 12 composti

66 Water LOGSY del CytC con Cloroamina T 700MHz 303K


Scaricare ppt "Lezione 4 Le costanti di accoppiamento Il rilassamento Accoppiamento dipolare."

Presentazioni simili


Annunci Google