Aspergillus flavus.

Presentazione sul tema: "Aspergillus flavus."— Transcript della presentazione:

1 Aspergillus flavus

2 Invasione dei tessuti delle cariossidi di mais
Mature B73 kernels naturally infected with Aspergillus flavus. A sagittal (1) and frontal (2) and transversal (3) section of healthy B73 kernels (left) were compared to disease kernels (right) to discern any physical changes that occurred as a result of A. flavus. Bolded letters denote kernel parts and tissues: a—crown; b— pericarp; c—aleurone; d—starchy endosperm; e—hard endosperm; f—scutellar tissue; g—leaf primordia (plumule); h—primary root; i—transfer cells; j—pedicel; k—embryo; and l—germ.

3 Invasione dei tessuti delle cariossidi di mais
Histology of the developing maize kernel 4 days after Aspergillus flavus pin-bar inoculation. The schematic drawing of the kernel (a) depicts the location of pin-bar inoculation (black arrow) and the kernel region (black box, ) from which the histology panels originate. Aspergillus flavus was observed (b) in the endosperm (EN) surrounding a cavity created by the inoculation pin and outside the germ (GM) in a unique A. flavus mat-like (A.f mat) structure. Hyphae were also found growing between the pericarp (PC) and aleurone (AL) (c) in which the AL cells in contact with A. flavus appear to be altered compared with cells in the noninoculated control (d). (e) Endosperm–germ interface (IF) in a noninoculated kernel. In the infected kernel, the A.f mat structure developed at the IF (f) and covered the germ tip. Hyphae within the A.f mat were morphologically distinct from A. flavus vegetative hyphae (g) and were highly branched, tightly intertwined and extended into the GM (h). Colonization of the GM by A. flavus was observed in highly infected kernels (i).

4 Aflatoxins: presentation
Discovered in 1962 Composed of: Coumarin group Bisfuran ring Pentan group AFB1 AFB2 AFG1 AFG2 Furan group AFB De ce fait nous nous sommes concentré sur les aflatoxines. Celles-ci ont été découverte en 1960 à la suite de la mort de 100aine de milliers de dindons en Angleterre. L’enquète a permis leurs découverte. Les aflatoxines B sont constituées d’un groupe coumarine centrale (ici en rouge) et d’un anneau bisfurane (ici en vert). L’AFB1 possédant cette double liaison alors que l’Aflatoxine B2 non. Et enfin d’un groupe pentan. Les aflatoxines G quant a elle ont un groupe furan qui remplace le pentan des B. AFG 2D structures of aflatoxin B1 (AFB1), aflatoxin B2 (AFB2), aflatoxin G1 (AFG1) and aflatoxin G2 (AFG2) PhD defence 11/25/2014

5 Aflatoxins: abiotic parameters
Growth Water activity: aw Temperature °C AFB1 production °C Concernant les paramètres abiotiques, Les conditions optimales pour la croissance fongiques ne sont pas les mêmes que celles de la production. Ainsi, si nous regardons l’impact de l’activité de l’eau sur la croissance, l’optimum est une aw comprise entre 0.94 et 0.99 alors que celle d’AFB1 est plutôt comprise entre 0.96 et Pour la température, la croissance optimale est comprise entre 30 et 35 alors que la production d’AFB1 est comprise entre 25 et 30°C. Ces facteurs sont les principaux, néanmoins d’autres facteurs abiotiques comme, la composition atmosphérique et du milieu, le pH, la lumière et l’ajout de composés chimiques ont un impact également. Other parameters: Gas composition, Medium, pH, Light, Chemical compounds

6 Aflatoxins: Biosynthesis
1 AcetylCOA & 9 MalonylCOA Norsolorinic Acid (NOR) Versicolorin B Sterigmatocystin AFB1 1 2 Les 29 gènes qui codent pour cette voie de biosynthèse sont regroupé dans un cluster. La voie de biosynthèse commence par l’ajout de 9 MalonylCoA à un AcetylCoA. Suite à plusieurs reactions biochimique illustrée dans la thèse, le premier précurseur stable de cette voie de biosynthèse l’acide Norsolorinique est produit. Par la suite, la Versicolorine B est le dernier précurseur avant la séparation des deux voies. La voie 1 est à l’origine de la formation de la mycotoxine sterigmatocystine et également de l’aflatoxine B1. En ce qui concerne la deuxième voie, elle est à l’origine de la production de l’aflatoxine B2. Les producteurs d’aflatoxines G, notamment A. parasiticus possèdent, l’intégralité du gène aflU qui code pour l’oxydase responsable de la conversion en aflatoxines G1 et G2. Cette voie de biosynthèse est régulée par divers mechanismes. AflU (NadA, AflF) (Yu et al., 2004) AFG1 AFG2 AFB2 11/25/2014

7 Aflatoxins: Regulation
AflR and AflS: specific regulators ( ) AflR: Zinc Finger transcription factor Specific binding 5’- WCGSNNNSCGA-3’ (W: A ou T, S: C ou G, R: A ou G) AflR et AflS sont 2 régulateurs spécifique de la voie de biosynthèse. Les gènes codant pour ceux-ci sont situé également dans le cluster. AflR est un facteur de transcription en doigt de Zinc qui se fixe sur une séquence d’ADN spécifique. AflS est notamment supposé etre un coctivateur d’AflR. D’autres régulateurs interviennent et impactent la voie de biosynthèse par le biai ou non d’AflR/AflS. Les voies de transduction issue de la réponse aux stimuli tel que le pH, le potentiel redox, la lumière ou la température sont partiellement connu. Par exemple, la lumière inhibe la formation du complexe Velvet et ceci empèche son action promotrice sur la biosynthèse d’aflatoxines. Ainsi, les dernières diapositives ont pu illustrer les différents mécanismes pouvant réprimer la production d’aflatoxines. Néanmoins, dans le cas d’une production résiduelle, des méthodologies de réduction existent. AflS: AflR coactivator? (Alkhayyat & Yu, 2014)

8 Regolazione della biosintesi delle AF
Quando FadA è attivato in seguito alla percezione di uno stimolo esterno inibisce sia direttamente che indirettamente, i.e. attraverso la cAMP-dependent PkaA, l’attivazione di AflR FlbA, la cui attivazione dipende da FluG, sopprime FadA e stimola l’attivazione di AflR (Georgianna and Payne, 2009).

9 Regolazione della biosintesi delle AF
Un complesso trimerico, chiamato il velvet complex (VelB-VeA-LaeA), è responsabile della sincronizzazione dello sviluppo con i cambiamenti metabolici in assenza della luce VelB è una proteina conservata nel regno fungino che ha un’identità aminoacidica del 18% con VeA ma non ha nessun NLS tipico (nuclear localization signal). VeA forma un complesso con VelB ed incrementa il trasporto di VelB nel nucleo. Poi, VeA collega VelB con il nuclear master regulator del metabolismo secondario, LaeA. (Bayram et al. 2008).

10 Controllo dell’espressione genica tramite modifiche della cromatina
Il substrato naturale per il meccanismo di trascrizione e delle proteine ​​regolatrici coinvolte nella segregazione dei cromosomi, la replicazione e riparazione del DNA nel nucleo degli eucarioti non è il DNA stesso, ma la cromatina. La cromatina si compone di proteine ​​nucleari strutturali come istoni e proteine ​​non-istoniche che sono strettamente associate con il DNA e che condensano la lunga molecola di DNA in un piccolo volume Sebbene l’imballaggio è essenziale e l'eliminazione di alcuni fattori modificanti la cromatina è letale, la cromatina rappresenta anche un notevole ostacolo per i fattori che legano il DNA per accedere alle proprie sequenze affini.

11 L’accessibilità alla cromatina è regolata principalmente a livello di modificazioni post-traduzionali (PTM) di proteine ​​istoniche che definisce il grado di compattazione da aperto (eucromatina ) a chiuso (eterocromatina) Le modificazioni delle proteine ​​mediante acetilazione, metilazione, ubiquitinazione e fosforilazione rappresentano le principali modifiche dei diversi amminoacidi presenti nel N -terminale e nei domini globulari degli istoni H2B , H3 , e H4 . Durante un ciclo di regolazione, queste modifiche possono essere rimosse da deacetilasi , demetilasi e fosfatasi, o una modifica può essere sostituita da un’altra sullo stesso residuo da parte di enzimi. Questi sono parte di complessi specializzati histone -modifying, come ad esempio le acetiltrasferasi saga/Ada o NuA4, SET -metiltransferasi o le istone deacetilasi

12 Le attività dinamiche di «scrittura e cancellazione» che modificano gli istoni risultano in combinazioni che cambiano spazialmente e temporalmente i diversi histones marks presenti in regioni codificanti geni regolativi e anche in zone di DNA non codificante. Queste combinazioni sono ritenute generare un "codice" che è riconosciuto da proteine ​​"lettrici". Il loro ruolo è quello di reclutare attivatori trascrizionali o repressori in queste posizioni codificate e di modificare la struttura della cromatina e la sua compattazione interagendo con fattori responsabili della formazione di eterocromatina . Poiché tali histones marks, proprio come la metilazione del DNA , possono essere trasmessi in modo stabile durante la meiosi alle cellule figlie, il codice istonico è diventato un componente integrato della regolazione epigenetica. Tuttavia, anche se la regolazione epigenetica impiega questi histones marks, la regolazione a livello della cromatina non fa necessariamente attivare un evento epigenetico.

13 Ma questa è solo una parte della verità, a seconda del:
In contrasto con l’acetilazione, che viene letto sostanzialmente sempre come un segno di attivazione cromatinica, la metilazione dell'istone rappresenta un linguaggio molto più complesso. La metilazione del H3K9, H3k27 e H4K20 è più frequentemente associata con l’eterocromatina e il silenziamento trascrizionale mentre la metilazione H3K4, H3K36 e H3K79 è più spesso - insieme con l’iperacetilazione di H3K9 – associata all’eucromatina attivamente trascritta. L’acetilazione e la metilazione avvengono esclusivamente sulle lisine e non possono mai coesistere contemporaneamente sullo stesso residuo. Ma questa è solo una parte della verità, a seconda del: grado di metilazione (mono-, di-, o trimethylation) di una data lisina, se il mark viene posto su un istone residente in una regione del promotore o nella sequenza codificante, La localizzazione cromosomica un dato mark di metilazione può essere letto come un segnale di attivazione o di repressione

14 The chromatin code of fungal secondary metabolite gene clusters
Il metabolismo secondario non è immediatamente essenziale per l'organismo, ma, tramite la produzione di metaboliti specifici, può influenzare la competitività in ambienti naturali e quindi sopravvivenza a lungo termine e la fecondità della specie. I geni coinvolti nella biosintesi di un certo metabolita di solito sono fisicamente collegati nel cromosoma (cluster) e co-regolati trascrizionalmente. L’ arrangiamento dei geni legati agli SM in cluster può essere state mantenuto anche perché la vicinanza dei geni consentirebbe un controllo coordinato trascrizionale mediante meccanismi chromatin-based

15 Regolazione della biosintesi delle AF
Un complesso trimerico, chiamato il velvet complex (VelB-VeA-LaeA), è responsabile della sincronizzazione dello sviluppo con i cambiamenti metabolici in assenza della luce VelB è una proteina conservata nel regno fungino che ha un’identità aminoacidica del 18% con VeA ma non ha nessun NLS tipico (nuclear localization signal). VeA forma un complesso con VelB ed incrementa il trasporto di VelB nel nucleo. Poi, VeA collega VelB con il nuclear master regulator del metabolismo secondario, LaeA. (Bayram et al. 2008).

16 LaeA and the crosstalk to histone methylation
LaeA influenza notevolmente lo stato di metilazione di H3K9 e l’occupazione successiva di questo locus da parte di HepA (proteina associata all’eterocromatina). Il legame di HepA sulla cromatina richiede la di- e tri- metilazione di H3K9. Il fatto che la perdita della funzione LaeA risulti in una elevata H3K9me3 e di livelli di HepA nel cluster ST, e che la delezione di HepA parzialmente by-passi il ruolo di LaeA per la trascrizione di diversi Cluster SM, suggerisce un ruolo di questo regolatore nella formazione dell’eterocromatina e nella repressione trascrizionale . l'esatto meccanismo del funzionamento di LaeA in questo processo resta ignoto ma potrebbe essere direttamente o indirettamente coinvolto nel blocco della formazione eterocromatina.

17 Questo porta ad una sequenza di eventi a valle, come
Gli effetti di inattivazione-HDAC dipendente e l'individuazione di strutture eterocromatiche nei cluster del metabolismo secondario fornisce un'ipotesi attraente per spiegare eventi di co - regolamentazione delle grandi regioni genomiche e del silenziamento trascrizionale dei geni biosintetici del SM durante il metabolismo primario. In questo modello, condizioni metaboliche secondarie farebbero scattare l'inversione dei segni eterocromatici e la deposizione di marks istone- attivanti quali l’acetilazione della lisina in H3 e H4 . In altre parole, entrambe le attività enzimatiche - la rimozione dei segnali eterocromatici repressivi e l’immissione di marks di attivazione eucromatica - devono essere reclutate presso i promotori dei geni SM in condizioni metaboliche secondarie. I complessi HAT sono reclutati in regioni nucleosome-free in promotori di geni specifici per le proteine ​​che legano il DNA . Questo porta ad una sequenza di eventi a valle, come l’iperacetilazione degli istoni, rimodellamento dei nucleosomi , montaggio del macchinario trascrizionale di base , e successivo reclutamento della RNApolimerasi II che si conclude con l'attività trascrizionale del promotore

18 Lo stress ossidativo regola la produzione di diverse micotossine
Diversi oxidant stressors aggiunti esogenamente quali perossido d'idrogeno, PUFA ossidati, epossidi, aldeidi, chetoni, ergosterolo perossidato, tetracloruro di carbonio e altri alogenometani inducono la biosintesi di alcune micotossine tra cui: Aflatossine (Fabbri et al., 1983) Deossinivalenolo (Ponts et al., 2004) Patulina (Castoria et al., 2005) Ocratossina A (Reverberi et al., 2010) 18 18 18

19 Un caso di studio: le aflatossine
L'invecchiamento cellulare (cell ageing) induce uno stato iperossidante nella cellula fungina che porta al differenziamento e all'attivazione del metabolismo secondario (Aguirre et al., 2007) La diminuzione delle difese antiossidanti nella cellula fungina genera un ambiente ossidativo che favorisce la produzione di aflatossine (Reverberi et al., 2007) Questo è stato verificato mediante la delezione del gene ApyapA che in A. parasiticus codifica un fattore di trascrizione capace di controllare la risposta antiossidativa (Reverberi et al., 2008) 19 19 19 19

20 Lavoro yap1 Il gene ApYapA codifica per un fattore di trascrizione correlato allo stress ossidativo ApYapA possiede diversi residui di cisteina che qualora ossidati, portano ad un cambio del suo folding che induce la sua migrazione nel nucleo ApYapA riconosce degli elementi risposta simili agli ARE (YRE-TGACTCA) presenti nel promotore di molti geni codificanti per enzimi antiossidanti quali superossido dismutasi e catalasi

21 Lavoro yap1 Il mutante ApyapA- presenta una forte alterazione nello sviluppo (produce molti più conidi del WT) e nel metabolismo secondario (la produzione di AF è anticipata e raggiunge prima il plateau) Uno YRE è stato trovato anche nel promotore di AflR il main regulator della sintesi di AF

22 yap1 yap1 Hsf2 Skn7 aflR Nucleo TGACTCA nGAAn TGACTCA aflR box
ACUTE-OXIDATIVE STRESS CHRONIC-OXIDATIVE STRESS O2-· OH· LOO· yap1 CRM1 SH yap1 Hsf2 Skn7 aflR Nucleo Cu, Zn-Sod, Mn-Sod, Cat, Gst, Gpx SH TGACTCA nGAAn AFTX gene cluster TGACTCA aflR box 22 22 22