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Sensibilità ai farmaci del micobatterio tubercolare: approccio genotipico con limpiego di microchip Enrico Tortoli.

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Presentazione sul tema: "Sensibilità ai farmaci del micobatterio tubercolare: approccio genotipico con limpiego di microchip Enrico Tortoli."— Transcript della presentazione:

1 Sensibilità ai farmaci del micobatterio tubercolare: approccio genotipico con limpiego di microchip Enrico Tortoli

2 Le resistenze del bacillo tubercolare cromosomiche cromosomiche sviluppo spontaneo di mutanti resistenti con frequenza compresa fra 1x10 -5 e 1x10 -6 sviluppo spontaneo di mutanti resistenti con frequenza compresa fra 1x10 -5 e 1x10 -6 selezione dei mutanti resistenti in caso di terapie incongrue selezione dei mutanti resistenti in caso di terapie incongrue

3 MDR-TB letalità superiore al 40% letalità superiore al 40% altissima incidenza nei paesi in via di sviluppo altissima incidenza nei paesi in via di sviluppo il genotipo Beijing il genotipo Beijing

4 Lantibiogramma tradizionale metodo delle proporzioni metodo delle proporzioni su Lowenstein-Jensen: gg su Lowenstein-Jensen: gg su 7H10/11: gg su 7H10/11: gg in terreno liquido (radiometrico, MGIT) 5-12 gg in terreno liquido (radiometrico, MGIT) 5-12 gg

5 I farmaci antitubercolari maggiori ISONIAZIDE: battericida; attiva sui batteri in rapida moltiplicazione; inibisce la sintesi degli ac. micolici ISONIAZIDE: battericida; attiva sui batteri in rapida moltiplicazione; inibisce la sintesi degli ac. micolici RIFAMPICINA: battericida; attiva sia sui batteri in rapida moltiplicazione che su quelli intracellulari a crescita rallentata; inibisce la sintesi proteica RIFAMPICINA: battericida; attiva sia sui batteri in rapida moltiplicazione che su quelli intracellulari a crescita rallentata; inibisce la sintesi proteica PIRAZINAMIDE: battericida (in associazione con lisoniazide), a pH acido, sui batteri intracellulari; meccanismo di azione sconosciuto PIRAZINAMIDE: battericida (in associazione con lisoniazide), a pH acido, sui batteri intracellulari; meccanismo di azione sconosciuto ETAMBUTOLO: batteriostatico; attivo sui batteri in rapida moltiplicazione; inibisce la sintesi della componente glucidica della parete ETAMBUTOLO: batteriostatico; attivo sui batteri in rapida moltiplicazione; inibisce la sintesi della componente glucidica della parete STREPTOMICINA: battericida; attiva solo sui batteri extracellulari in rapida moltiplicazione; blocca la sintesi proteica STREPTOMICINA: battericida; attiva solo sui batteri extracellulari in rapida moltiplicazione; blocca la sintesi proteica

6 Mutazioni e resistenze nella grande maggioranza dei ceppi resistenti ai farmaci antitubercolari sono state individuate mutazioni in determinate regioni geniche nella grande maggioranza dei ceppi resistenti ai farmaci antitubercolari sono state individuate mutazioni in determinate regioni geniche per nessun farmaco sono state trovate mutazioni associate al 100% delle resistenze per nessun farmaco sono state trovate mutazioni associate al 100% delle resistenze in molti casi il meccanismo di resistenza rimane oscuro in molti casi il meccanismo di resistenza rimane oscuro

7 Isoniazide I è noto da tempo che, in molti ceppi isoniazide-resistenti, lattività catalasica è ridotta o assente è noto da tempo che, in molti ceppi isoniazide-resistenti, lattività catalasica è ridotta o assente tale difetto nella produzione di catalasi è il risultato di mutazioni nel gene katG (gene della catalasi-perossidasi) tale difetto nella produzione di catalasi è il risultato di mutazioni nel gene katG (gene della catalasi-perossidasi) circa il 55% dei ceppi isoniazide-resistenti presentano mutazioni nel gene katG circa il 55% dei ceppi isoniazide-resistenti presentano mutazioni nel gene katG lattività battericida dellisoniazide si manifesta soltanto in seguito allossidazione del farmaco operata dellenzima catalasi-perossidasi lattività battericida dellisoniazide si manifesta soltanto in seguito allossidazione del farmaco operata dellenzima catalasi-perossidasi circa il 10% dei ceppi isoniazide-resistenti che presentano il gene katG mutato hanno mutazioni anche nel gene ahpC codificante per una alchil-idroperossido reduttasi circa il 10% dei ceppi isoniazide-resistenti che presentano il gene katG mutato hanno mutazioni anche nel gene ahpC codificante per una alchil-idroperossido reduttasi lintroduzione del gene katG wild-type in mutanti isoniazide-resistenti ripristina la sensibilità al farmaco lintroduzione del gene katG wild-type in mutanti isoniazide-resistenti ripristina la sensibilità al farmaco

8 Isoniazide II circa il 30% dei ceppi isoniazide-resistenti presentano mutazioni nel gene inhA che codifica per un enzima coinvolto nella sintesi degli acidi micolici; il prodotto del gene inhA potrebbe essere il bersaglio dellisoniazide; le mutazioni sono responsabili di over- espressione del gene circa il 30% dei ceppi isoniazide-resistenti presentano mutazioni nel gene inhA che codifica per un enzima coinvolto nella sintesi degli acidi micolici; il prodotto del gene inhA potrebbe essere il bersaglio dellisoniazide; le mutazioni sono responsabili di over- espressione del gene mutazioni del gene kasA, codificante una proteina che regola lallungamento degli acidi grassi, sono presenti nel 15% dei ceppi isoniazide-resistenti. La proteina suddetta potrebbe essere il bersaglio dellisoniazide mutazioni del gene kasA, codificante una proteina che regola lallungamento degli acidi grassi, sono presenti nel 15% dei ceppi isoniazide-resistenti. La proteina suddetta potrebbe essere il bersaglio dellisoniazide MECCANISMO DI AZIONE: inibizione della biosintesi degli ac. micolici MECCANISMO DI AZIONE: inibizione della biosintesi degli ac. micolici

9 Rifampicina oltre il 97% dei ceppi resistenti alla rifampicina presentano mutazioni missense nel gene rpoB codificante per la subunità della RNA-polimerasi oltre il 97% dei ceppi resistenti alla rifampicina presentano mutazioni missense nel gene rpoB codificante per la subunità della RNA-polimerasi le alterazioni nella RNA-polimerasi, conseguenti alle mutazioni, non consentono il legame della rifampicina che non può quindi interferire nella trascrizione del rRNA le alterazioni nella RNA-polimerasi, conseguenti alle mutazioni, non consentono il legame della rifampicina che non può quindi interferire nella trascrizione del rRNA

10 Etambutolo il 50% circa dei ceppi resistenti alletambutolo presentano mutazioni nel gene embB, uno dei geni del locus emb che codifica per varie arabinosil-transferasi il 50% circa dei ceppi resistenti alletambutolo presentano mutazioni nel gene embB, uno dei geni del locus emb che codifica per varie arabinosil-transferasi le arabinosil-transferasi, che consentono la polimerizzazione dellarabinano nei polisaccaridi della parete, costituiscono il bersaglio delletambutolo; in caso di mutazione si ha over-espressione le arabinosil-transferasi, che consentono la polimerizzazione dellarabinano nei polisaccaridi della parete, costituiscono il bersaglio delletambutolo; in caso di mutazione si ha over-espressione

11 Pirazinamide la pirazinamide viene trasformata, dalla pirazinamidasi, in acido pirazinoico che ne costituisce il principio attivo; la maggior parte dei ceppi resistenti alla pirazinamide mancano di pirazinamidasi la pirazinamide viene trasformata, dalla pirazinamidasi, in acido pirazinoico che ne costituisce il principio attivo; la maggior parte dei ceppi resistenti alla pirazinamide mancano di pirazinamidasi oltre l80% dei ceppi pirazinamide-resistenti presentano mutazioni nel gene pncA codificante per la pirazinamidasi oltre l80% dei ceppi pirazinamide-resistenti presentano mutazioni nel gene pncA codificante per la pirazinamidasi

12 Streptomicina alcuni ceppi streptomicina-resistenti presentano mutazioni nel gene rpsL che codifica per la proteina ribosomiale S12 alcuni ceppi streptomicina-resistenti presentano mutazioni nel gene rpsL che codifica per la proteina ribosomiale S12 altri ceppi streptomicina-resistenti presentano mutazioni nel gene rrs che codifica per il rRNA 16S altri ceppi streptomicina-resistenti presentano mutazioni nel gene rrs che codifica per il rRNA 16S le suddette mutazioni, che si ritrovano complessivamente nel 70% circa dei ceppi resistenti, impediscono il legame dellantibiotico al 16S rRNA e bloccano quindi il meccanismo con cui la streptomicina inibisce la sintesi proteica le suddette mutazioni, che si ritrovano complessivamente nel 70% circa dei ceppi resistenti, impediscono il legame dellantibiotico al 16S rRNA e bloccano quindi il meccanismo con cui la streptomicina inibisce la sintesi proteica nessuna mutazione risulta per il momento associata al rimanente 30% dei ceppi streptomicina-resistentI nessuna mutazione risulta per il momento associata al rimanente 30% dei ceppi streptomicina-resistentI

13 Metodi genotipici di ricerca delle resistenze ricerca delle mutazioni associate con le resistenze ricerca delle mutazioni associate con le resistenze sequenziamento genico sequenziamento genico Single Strand Conformation Polymorphism Single Strand Conformation Polymorphism Restriction Fragment Lenght Polymorphism Restriction Fragment Lenght Polymorphism ibridizzazione in fase solida ibridizzazione in fase solida formazione di eteroduplex formazione di eteroduplex tutte le tecniche richiedono la preventiva amplificazione delle sequenze in cui si ricercano le mutazioni tutte le tecniche richiedono la preventiva amplificazione delle sequenze in cui si ricercano le mutazioni

14 Microarray sistemi miniaturizzati in cui su un supporto solido sono immobilizzate, legate alle singole postazioni di una matrice, catene di ac. nucleico sistemi miniaturizzati in cui su un supporto solido sono immobilizzate, legate alle singole postazioni di una matrice, catene di ac. nucleico microchip: microarray commerciale, preconfezionato, in cui le singole postazioni possono, o meno, essere controllate elettronicamente microchip: microarray commerciale, preconfezionato, in cui le singole postazioni possono, o meno, essere controllate elettronicamente identificazione, in fasi successive, delle eventuali mutazioni presenti in una determinata regione geniche di vari ceppi (amplicon down) identificazione, in fasi successive, delle eventuali mutazioni presenti in una determinata regione geniche di vari ceppi (amplicon down) identificazione di una specifica mutazione in molti ceppi contemporaneamente (capture down) identificazione di una specifica mutazione in molti ceppi contemporaneamente (capture down)

15 Amplicon down mancata ibridizzazione = probabile resistenza, da confermare cimentando in successione sonde con differenti mutazioni fino al raggiungimento dellibridazione (possibilità di usare coppie di sonde marcate con differenti fluorocromi) mancata ibridizzazione = probabile resistenza, da confermare cimentando in successione sonde con differenti mutazioni fino al raggiungimento dellibridazione (possibilità di usare coppie di sonde marcate con differenti fluorocromi) legame, a vari microelettrodi, degli amplificati della regione in esame ottenuti da altrettanti ceppi legame, a vari microelettrodi, degli amplificati della regione in esame ottenuti da altrettanti ceppi ibridizzazione = sensibilità ibridizzazione = sensibilità aggiunta di una sonda wild-type marcata aggiunta di una sonda wild-type marcata impiego di numerose sonde per ciascuna regione da monitorare

16 Capture down legame ai vari microelettrodi di varie sonde, ciascuna specifica per una diversa mutazione della regione genica di interesse legame ai vari microelettrodi di varie sonde, ciascuna specifica per una diversa mutazione della regione genica di interesse aggiunta dellamplificato in esame aggiunta dellamplificato in esame aggiunta di una nuova sonda (marcata), specifica per un tratto privo di mutazioni della regione amplificata aggiunta di una nuova sonda (marcata), specifica per un tratto privo di mutazioni della regione amplificata rivelazione dellamplificazione grazie alla marcatura rivelazione dellamplificazione grazie alla marcatura impiego di numerosi microelettrodi per ciascuna regione da monitorare

17 Eteroduplex legame, a ciascun microelettrodo, dellamplificato di un ceppo in esame legame, a ciascun microelettrodo, dellamplificato di un ceppo in esame aggiunta di una sonda wild-type aggiunta di una sonda wild-type aggiunta una proteina di E. coli, implicata nei meccanismi di riparazione del DNA, che ha la caratteristica di legarsi alle doppie catene di ac. nucleico che presentano mismatch aggiunta una proteina di E. coli, implicata nei meccanismi di riparazione del DNA, che ha la caratteristica di legarsi alle doppie catene di ac. nucleico che presentano mismatch legame = eteroduplex = resistenza legame = eteroduplex = resistenza assenza di legame = duplex omogeneo = sensibilità assenza di legame = duplex omogeneo = sensibilità impiego di una sola sonda e di un singolo microelettrodo per ciascuna regione da monitorare

18 Conclusioni la determinazione genotipica delle resistenze permette di ottenere risultati con un mese di anticipo rispetto ai metodi tradizionali la determinazione genotipica delle resistenze permette di ottenere risultati con un mese di anticipo rispetto ai metodi tradizionali i microarray sono attualmente lunica tecnologia con potenzialità di monitorare lintero spettro delle mutazioni associate a resistenze nel bacillo tubercolare i microarray sono attualmente lunica tecnologia con potenzialità di monitorare lintero spettro delle mutazioni associate a resistenze nel bacillo tubercolare la sensibilità genotipica deve sempre essere confermata dal test fenotipico la sensibilità genotipica deve sempre essere confermata dal test fenotipico false sensibilità: in caso di resistenze non associate a mutazioni note false sensibilità: in caso di resistenze non associate a mutazioni note false resistenze: in presenza di una proporzione di mutanti resistenti al disotto della soglia del 1% false resistenze: in presenza di una proporzione di mutanti resistenti al disotto della soglia del 1%


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