Next Generation Sequencing (NGS) Illumina HiSeq 2000: 150 milioni di frammenti di 100 bp in una settimana. 1)Assemblaggio di genomi de novo 2)Analisi della cromatina ( Chip-Seq ) 3)Analisi del trascrittoma (RNA-Seq ) 4)Analisi dello stato di metilazione (Bisulfite-Seq, RRBS, MeDIP-Seq) ….

Chromatin immunoprecipitation sequencing (Chip-Seq) L’immunoprecipitazione della cromatina è una tecnica che permette di identificare il sito di legame di una proteina (fattore di trascrizione, istone modificato, RNA polimerasi..) al DNA.

1) Le cellule sono trattate con la formaldeide che stabilizza il legame tra le proteine ed il DNA (Crosslinking ) In Laboratorio Chromatin immunoprecipitation sequencing (Chip-Seq)

2) Le cellule sono lisate e la cromatina è sottoposta a sonicazione. In Laboratorio Chromatin immunoprecipitation sequencing (Chip-Seq)

3) Vengono aggiunti anticorpi specifici contro la proteina di interesse che portano legate sferette magnetiche (beads), dopo che è avvenuto il legame anticorpo- proteina si centrifuga in modo da effettuare un processo di immunoselezione. In Laboratorio Chromatin immunoprecipitation sequencing (Chip-Seq)

4) Infine si purificano i frammenti di DNA. In Laboratorio Chromatin immunoprecipitation sequencing (Chip-Seq)

Input: Frammenti di DNA Output: File con le sequenze in formato FASTQ In Laboratorio Chromatin immunoprecipitation sequencing (Chip-Seq)

File FASTQ Ciascuna sequenza è identificata da 4 righe: -La prima riga comincia con il a cui segue il nome della sequenza -La seconda riga presenta il vero e proprio codice della sequenza -La terza riga comincia con il simbolo + ed è seguita da commenti opzionali -La quarta ed ultima riga contiene simboli che corrispondono a valori i che rappresentano la qualità di ciascuna base sovrastante. Esistono diverse codifiche e dipendono dal sequenziatore utilizzato. Chromatin immunoprecipitation sequencing (Chip-Seq)

Le sequenze devono essere mappate sul genoma utilizzando programmi di allineamento quali Bowtie. Sequenze+GenomaCoordinate genomiche Bowtie Chromatin immunoprecipitation sequencing (Chip-Seq) 1) MAPPING

Bisogna trovare le regioni arricchite di sequenze con programmi quali MACS. Chromatin immunoprecipitation sequencing (Chip-Seq) 2) Peak finding

In definitiva le sequenze (reads) selezionate sono quelle che sul genoma venivano riconosciute e legate dalla proteina di interesse. Chromatin immunoprecipitation sequencing (Chip-Seq)