Espressione dell’integrina-α4 e immunoattivazione dei linfociti T in soggetti con infezione da HIV-1 in trattamento antiretrovirale. Iannetta Marco 1, 2, Zingaropoli Maria Antonella 1, D’Abramo Alessandra 1, Oliva Alessandra 1, D’Agostino Claudia 1, D’Ettorre Gabriella 1, Lichtner Miriam 1, Mastroianni Claudio Maria 1, Vullo Vincenzo 1, Ciardi Maria Rosa 1 1 Dipartimento di Sanità Pubblica e Malattie Infettive, Sapienza, Roma, 2 INSERM U1016 Parigi, Francia

Background La terapia antiretrovirale (ARV) è in grado di aumentare l’aspettativa di vita dei pazienti con infezione da HIV-1 (Samji H, et al. PLoS ONE. 2013) L’immunoattivazione residua e le comorbidità (neurologica, renale, ossea, cardiovascolare) rapprasentano degli aspetti rilevanti, i cui meccanismi non sono ancora del tutto noti (Hunt PW. Curr Opin HIV AIDS. 2014) Le integrine sono un sistema di molecole transmembranarie responsabili dei meccanismi di interazione cellula-cellula e cellua- matrice extracellulare L’integrina-α4 (CD49d) è implicata nel “homing” linfocitario verso il sistema nervoso centrale (α4β1) e l’intestino (α4β7) (Lobb RR et al. J Clin Invest. 1994) L’integrina-α4 (CD49d) è implicata nei processi di attivazione linfocitaria (Ugawa T et al., J Immunol. 1996) Scopo dello studio è stato quello di valutare l’espressione dell’integrina- α4 nei linfociti T di pazienti con infezione da HIV-1, in terapia ARV e carica virale non rilevabile.

Materiali e Metodi Sono stati arruolati nello studio – 27 soggetti HIV-1 positivi (5F/22M) in terapia ARV e con viremia non rilevabile da almeno un anno. – 15 soggetti sani (6F/9M), come gruppo di controllo. – Non sono state rilevate differenze significative nell’età mediana dei due gruppi Analisi immunofenotipica in citofluorimetria : – Protocollo “lyse and wash” su campioni di sangue intero eparinato – Studio dell’immunoattivazione e immunosenescenza dei linfociti T: CD3, CD4, CD8, HLA-DR, CD38, CD57, CD28. Utilizzo della tecnica della “fluorescence minus one” (FMO) per stabilire i limiti di positività per CD38 e HLA-DR – Studio delle forme maturative e dell’espressione dell’integrina-α4 : CD45, CD3, CD4, CD8, CD45RO, CD27, CD49d e corrispondente isotipo – Acquisizione su citofluorimetro MACSQuant (Miltenyi) – Analisi dei dati mediante software FlowJo Analisi statistiche effettuate mediante software GraphPadPrism ver 6.0 utilizzando test non parametrici

Gating Strategy Gating Strategy: L’immunoattivazione dei linfociti T è stata valutata sulla base dell’espressione di CD38 ed HLA-DR L’immunosenescenza dei linfociti T è stata valutata mediante la quantificazione della percentuale degli eventi CD28 - CD57 + I subset maturativi dei linfociti T sono stati determinati sulla base dell’espressione dei linfociti CD45RO e CD27 (N: naïve, CM: central memory, EM: effector memory, E: effectors, I: intermediate) L’espressione del CD49d è stata valutata mediante misurazione della Median Fluorescence Intensity (MFI)

Risultati 1: immunoattivazione e senescenza Riduzione della conta dei CD4 nei soggetti HIV-1+ (p<0.0001) Incremento dei livelli di CD4 HLA-DR+CD38+ nei soggetti HIV-1+ (p=0.001) Incremento dei livelli di CD4 CD28-CD57+ nei soggetti HIV- 1+ (p<0.001)

Risultati 1: immunoattivazione e senescenza Riduzione della conta dei CD4 nei soggetti HIV-1+ (p<0.0001) Incremento dei livelli di CD4 HLA-DR+CD38+ nei soggetti HIV-1+ (p=0.001) Incremento dei livelli di CD4 CD28-CD57+ nei soggetti HIV- 1+ (p<0.001) Incremento della conta dei CD8 nei soggetti HIV-1+ (p<0.0001) Incremento dei livelli di CD8 HLA-DR+CD38+ nei soggetti HIV-1+ (p=0.003) Invariati i livelli di CD8 CD28- CD57+ dei soggetti HIV-1+ rispetto ai controlli (p=0.8)

Risultati 1: immunoattivazione e senescenza Riduzione della conta dei CD4 nei soggetti HIV-1+ (p<0.0001) Incremento dei livelli di CD4 HLA-DR+CD38+ nei soggetti HIV-1+ (p=0.001) Incremento dei livelli di CD4 CD28-CD57+ nei soggetti HIV- 1+ (p<0.001) Incremento della conta dei CD8 nei soggetti HIV-1+ (p<0.0001) Incremento dei livelli di CD8 HLA-DR+CD38+ nei soggetti HIV-1+ (p=0.003) Invariati i livelli di CD8 CD28- CD57+ dei soggetti HIV-1+ rispetto ai controlli (p=0.8) I livelli di attivazione dei linfociti T CD4+ correlano negativamente con la conta assoluta (e percentuale) dei CD4 (Sperman R=-0.63, p<0.001)

Risultati 2: subset maturativi dei linfociti T Non abbiamo riscontrato differenze nei livelli delle forme maturative dei linfociti T CD4+ nei soggetti HIV-1+ e nei controlli

Risultati 2: subset maturativi dei linfociti T Non abbiamo riscontrato differenze nei livelli delle forme maturative dei linfociti T CD4+ nei soggetti HIV-1+ e nei controlli Nei soggetti HIV-1+ abbiamo riscontrato una diminuzione dei CD8 Naïve (p=0.013) ed un’espansione dei CD8 Effector Memory (p=0.015) ed Effector (p=0.07), rispetto ai controlli

Risultati 3: espressione del CD49d I livelli di MFI di CD49d sono risultati aumentati nei CD4 e nei CD8 dei soggetti HIV-1+ rispetto ai controlli (p=0.002 e p=0.003, rispettivamente)

Risultati 3: espressione del CD49d I livelli di MFI di CD49d sono risultati aumentati nei CD4 e nei CD8 dei soggetti HIV-1+ rispetto ai controlli (p=0.002 e p=0.003, rispettivamente) Per i CD4, i livelli di MFI di attivazione (HLA-DR+CD38+) correlano positivamente con ila MFI di CD49d (Spearman R=0.54, p=0.038). In particolare la MFI di CD49d sembra correlare fortemente con HLA-DR (Spearman R=0.64, p<0.001) ma non con CD38 (p=0.34)

Risultati 3: espressione del CD49d I livelli di MFI di CD49d sono risultati aumentati nei CD4 e nei CD8 dei soggetti HIV-1+ rispetto ai controlli (p=0.002 e p=0.003, rispettivamente) Per i CD4, i livelli di MFI di attivazione (HLA-DR+CD38+) correlano positivamente con ila MFI di CD49d (Spearman R=0.54, p=0.038). In particolare la MFI di CD49d sembra correlare fortemente con HLA-DR (Spearman R=0.64, p<0.001) ma non con CD38 (p=0.34) Per i CD8, la MFI di CD49 correla solo debolmente con i livelli di espressione di HLA-DR (Spearman R=0.47, p<0.012).

Conclusioni Nei pazienti HIV-1 in terapia ARV con soppressione della carica virale, persiste uno stato di attivazione cronica dei linfociti T CD4+ e CD8+ Il persistente stato di attivazione dei linfociti T CD4+ è associato ad una ridotta conta dei CD4 Nei soggetti HIV-1+ i CD8 sono attivati, con una riduzione della componente naïve ed un aumento delle sottopopolazioni Effector Memory ed Effector L’espressione dell’integrina-α4 è aumentata sui linfociti T CD4+ e CD8+ dei soggetti HIV-1+ rispetto ai controlli Nei CD4 dei soggetti HIV-1+ l’immunoattivazione (ed in particolare la quota di cellule HLA-DR+) sembra essere correlata all’espressione dell’integrina-α4. L’ integrina-α4 può essere implicata nei meccanismi di attivazione linfocitaria, infiltrazione tissutale e successivo danno d’organo.

Prospettive Studio della funzione dei linfociti T CD4+ e CD8+ (proliferazione e produzione citochinica) in relazione all’espressione di CD49d Evidenze sul ruolo dell’integrina-α4 nel danno cardiovascolare, nel modello di infezione da SIV dei macachi (Macaca mulatta). Possibilità di interferire sull’immunopatogenesi bloccando l’integrina-α4 ed inibendo la migrazione di monociti e macrofagi nel tessuto cardiaco Possibile target terapeutico per la modulazione del sistema immunitario in corso di terapia ARV nei pazienti HIV-1+ per ridurre le morbidità non-AIDS correlate

Ringraziamenti Zingaropoli Maria Antonella D’Abramo Alessandra Oliva Alessandra D’Agostino Claudia D’Ettorre Gabriella Lichtner Miriam Mastroianni Claudio Maria Vullo Vincenzo Ciardi Maria Rosa Laboratorio di Immunologia del Dipartimento di Sanità Pubblica e Malattie Infettive “Sapienza”, Università di Roma Personale Medico ed Infermieristico del Reparto di Malattie Infettive del Policlinico Umberto I di Roma. Grazie dell’attenzione

CD49d relative expression on CD4 CD49d relative expression on CD8 Supplemento 1

Supplemento 2