Biochimica classica CAMPIONI BIOLOGICI Diagnostica molecolare

Preparazione del paziente “ Il prelievo va effettuato sul paziente riposato e a digiuno da almeno 6-8 ore ” Nessuna interferenza con gli acidi nucleici!!!

Il prelievo venoso

È una tecnica che permette l’accesso alle vene attraverso un ago o un catetere, di solito è utilizzata per prelevare il sangue o per iniziare una infusione venosa È una procedura sterile fin quando la cute non è lesa Venopuntura

Precauzioni generali Lavare le mani e indossare guanti monouso Identificare il paziente Verificare la corrispondenza tra paziente-richiesta-provette Selezionare le provette appropriate (per l’estrazione del DNA : EDTA) Materiale per il prelievo venoso

Per effettuare il prelievo si utilizza un ago corto e affilato. Il prelievo viene solitamente effettuato alla cresta iliaca posteriore, allo sterno o alla cresta iliaca anteriore (nei bambini). Il prelievo di sangue midollare è molto breve; bastano pochi secondi per prelevare la quantità di siero necessaria. Il sangue midollare viene poi posto sui vetrini, strisciato e colorato, pronto per essere analizzato. Prelievo di Sangue Midollare

Prelievo di Saliva Indagini medico-legali Nutrigenomica Test virali (HIV)

Guthrie spots Ipotiroidismo congenito: (deficit dell’ormone tiroideo TSH) Fenilchetonuria: ( alti tassi di fenilpiruvato nelle urine e di fenilalanina nel sangue) Fibrosi Cistica : alterazione del funzionamento dei canali del cloro nelle membrane delle cellule a secrezione esterna Etc..

È il prelievo dei villi coriali che costituiscono il tessuto placentare. Si esegue tra 10 e 13 settimane compiute di gravidanza Permette di diagnosticare anomalie cromosomiche e genetiche, nonchè di stabilire su richiesta la paternità del feto. Comporta un rischio di aborto dell'1%, dipendente dalla manualità dell'operatore La villocentesi Rispetto all’amniocentesi, fornisce una risposta più rapida (5 giorni dal prelievo) e più precoce (entro 13 settimane di gravidanza).

Tali malattie sono diagnosticabili nelle gravidanze a rischio specifico, cioè quando sussiste una familiarità o quando si sono rivelate in una gravidanza precedente. Distrofia muscolare Fibrosi cistica Talassemie Emofilia A e B Fenilchetonuria Corea di Huntington Sindrome adrenogenitale S. di Werdning Hoffman Immagine al microscopio di alcuni villi coriali (5 mg) Principali malattie genetiche diagnosticabili con l’analisi del DNA estratto dai villi coriali

Liquido amniotico Contiene cellule di origine fetale che possono essere messe in coltura per i successivi test diagnostici Viene prelevato mediante l’amniocentesi

L’amniocentesi È una procedura mediante la quale, sotto controllo ecografico, un campione di liquido amniotico (circa 20 ml) viene prelevato attraverso l’addome mediante l’uso di una siringa. Viene effettuata tra la 15 a e la 17 a sett. di gravidanza Permette di diagnosticare anomalie cromosomiche e genetiche, nonchè di stabilire su richiesta la paternità del feto. La principale complicanza è un aumento dell’0,5-1% al di sopra del normale rischio del 2-3 % di aborto.

Per ogni tipo di campione biologico in diagnostica molecolare clinica, esiste una determinata tecnica di biologia molecolare per l’isolamento del tipo cellulare d’interesse

Il prelievo in Oncoematologia Campione biologico:linfociti Leucemie acute: sangue midollare Leucemia mieloide cronica: sangue periferico Buffy Coat: tecnica per l’isolamento dei linfociti da sangue intero

Il Buffy-coat è costituito dai componenti del sangue ottenuti mediante centrifugazione di un’unità di sangue intero e contenente una notevole quantità di leucociti e piastrine. Metodica Buffy-coat Sangue Periferico

Sangue intero Sangue dopo centrifugazione WBCs e RBCs dopo rimozione del plasma WBCs (buffy-coat) visto dall’alto Campione dopo la rimozione del buffy-coat Purificazione del Buffy-coat Metodica Buffy-coat Sangue Periferico

Modalità di invio del campione biologico: requisiti minimi Spedizione del materiale al Laboratorio di pertinenza Istruzioni specifiche di conservazione Modificazioni in vitro che alterano il risultato dell’analisi Spedizione del campione a temperatura controllata

- Trasportare i campioni a Temperatura Ambiente (15-25°C) entro 24h * -Tali condizioni consentono di preservare la vitalità cellulare e quindi l’integrità degli acidi nucleici. (20%degradazione in 24h; 50% in 48 h) (Hughes et al Disord.Hematologic malignancies 2006) Esempio per i campioni oncoematologici

Prelievo Richiesta Accettazione Indagini di laboratorio (estrazione degli a. nucleici, PCR,etc) Interpretazione del risultato Refertazione eventuale consulenza genetica Dal campione biologico al referto FasePre-analiticaFasePre-analitica FaseAnaliticaFaseAnalitica FasePost-analiticaFasePost-analitica

i Estrazione e quantizzazione degli acidi nucleici Rischio biologico GUANTI MONOUSO PUNTALI CON FILTRO

Metodiche di estrazione Fenolo/Cloroformio Kit commerciali Sistema automatizzato

tipo di acido nucleico da estrarre (DNA o RNA) materiale di partenza (sangue, tessuto, coltura cellulare, altro) risultato desiderato in termini di resa, purezza, tempo impiegato applicazione prevista post-estrazione La scelta del metodo si esegue in base a:

Lisi della membrana cellulare Denaturazione e separazione delle proteine Isolamento gli acidi nucleici dai residui cellulari associati Estrazione acidi nucleici:fasi

Estrazione del DNA: metodo del fenolo Lisi delle membrane con detergente:SDS Trattamento con enzimi proteolitici: es. proteinasi K Estrazione con solventi organici (fenolo/cloroformio) che denaturano le proteine e le veicolano nella fase organica Precipitazione delle proteine utilizzando sali ad elevata concentrazione (salting-out)

Estrazioni differenziali in Fenolo pH neutro o alcalino Fase acquosa (DNA e RNA) Interfaccia (proteine denaturate) Fase fenolica (proteine solubili)

Estrazione del DNA precipitazione degli acidi nucleici dalla fase acquosa La precipitazione degli acidi nucleici si ottiene usando varie combinazioni di sali ed alcool (es. NH4OAc 2M ed etanolo %) I sali si complessano con gli acidi nucleici, riducendone fortemente la solubilità in etanolo o isopropanolo

Precipitazione degli acidi nucleici

Svantaggi delle metodiche convenzionali Tempi di estrazione molto lunghi Utilizzo di reagenti caustici e/o tossici Possibile perdita di DNA o contaminazione da proteine negli strati interfasici Possibile frammentazione meccanica del DNA

Sviluppo di metodiche alternative Riduzione dei tempi Eliminazione dei reagenti tossici Riduzione delle contaminazioni da proteine

Le metodiche alternative sono diversificate in funzione: Del tipo di acido nucleico che si vuole purificare Dalla numerosità, dalla quantità e dal tipo di campione di partenza Dal tempo a disposizione per eseguire l’estrazione Dagli esperimenti che seguono all’estrazione Sviluppo di metodiche alternative

piccole quantità di campione di partenza Campioni biologici: sangue fresco o congelato (1–100 µl), campioni prelevati a scopo forense/tessuto (<10 mg tessuto) sangue su cartoncino (~3 mm diametro) Rapido (30 minuti) Elevata qualità di DNA Estrazione di DNA su colonnina

Estrazione su Membrana di silice Il DNA è contenuto nella fase superiore Strato solido di resina Le proteine sono contenute nella fase organica

*I passaggi si eseguono per centrifugazione Alcune sostanze che potrebbero inibire la PCR (cationi divalenti e proteine) sono completamente rimosse in due step di lavaggio DNA si lega ad una membrana di gel e silicone, mentre i contaminanti passano attraversano Il DNA purificato può essere eluito in acqua distillata e autoclavata Lisi delle membrane cellulari e degradazione delle proteine con Cloruro di Guanidinio e Proteinasi K Il sangue intero viene incubato con una soluzione di lisi.

Vantaggi Tempi ridotti (1 ora) Quantitativo di sangue di partenza fino a 100  L Svantaggi Quantità di DNA ottenuta non adeguata a tutte le metodiche PCR Costo elevato del kit

Nasce dall’esigenza di ridurre i costi aumentando la produttività Tutte le variabili ed i rischi associati alla preparazione manuale dei campioni vengono eliminati aumento della standardizzazione e della sicurezza delle indagini di diagnostica molecolare Estrattore automatico

Estrazione con estrattore automatico Lisi delle membrane cellulari con buffer di lisi Aggiunta di particelle magnetiche che legano il DNA Eluizione dei contaminanti e ritenzione del DNA mediante magnete Distacco delle particelle magnetiche con buffer di lavaggio Ritenzione delle particelle mediante magnete ed eluizione del DNA

Magnetic Nucleic Acid Purification ABCDEFGH A) Aggiungere le cellule al “sample cartridge”. B/C) Aggiungere buffer di lisi per lisare le cellule e degradare il DNA D) Aggiungere le biglie di vetro magnetiche capaci di legare l’RNA in superfice. E) Le biglie leganti l’RNA sono intrappolate nella punta grazie all’applicazione di un campo magnetico. F-H) L’RNA è sottoposto a lavaggi ed eluito dalle biglie ad una temperatura di 70°C mentre le biglie sono eliminate con il puntale. L’RNA è conservato a 4°C fino alla rimozione. lisi legame eluizione

Vantaggi Tempi ridotti (1 ora) Quantitativo di sangue da 0,1 a 1 mL 32 campioni estraibili contemporaneamente Automatizzazione e limitazione degli errori Pochi reagenti da usare Alto grado di purezza del DNA Svantaggi Quantità di DNA ottenuta non adeguata a tutte le metodiche Costo elevato dell’apparecchiatura

Quantificazione Spettrofotometrica Lettura dell’assorbanza a 260 nm UV Le proteine eventualmente presenti nella preparazione di DNA assorbono a 280 nm UV Il rapporto di assorbanza 260/280 fornisce una stima della purezza del campione di DNA Soluzioni pure di DNA hanno un rapporto 260/280pari a 1,8 Soluzioni pure di DNA hanno un rapporto 260/280 pari a 1,8 Determinazione della concentrazione del DNA Analisi quantitativa

METODO SPETTROFOTOMETRICO Sfrutta la capacità degli acidi nucleici di assorbire la luce UV ad una lunghezza d’onda di 260 nm

Valutazione qualitativa degli acidi nucleici (I) Polo positivo Polo negativo

CONTROLLO INTEGRITÀ E QUANTITÀ DNA Sm RNA Valutazione qualitativa degli acidi nucleici (II)

Nanodrop Spettrofotometro di nuova generazione, capace di un’analisi accurata su un volume molto piccolo di campione (1  L). Il sistema brevettato si basa sul principio della tensione superficiale che piccoli volumi di liquidi esercitano quando sono collocati tra due superfici vicine.

1 ul di campione Non bisogna cambiare la cuvetta o il capillare Non bisogna diluire i campioni La lettura è effettuata in 10 secondi Piccolo ingombro Tutti i dati sono automaticamente archiviati in un file sul PC collegato Vantaggi

concentrazione Campione di DNA

Campione di DNA frammentato

Estrazione e quantizzazione degli acidi nucleici Post-PCR Pre-PCR Accettazione Refertazione

PUNTALI CON FILTRO GUANTI MONOUSO Area PCR TUBINI PCR CESTELLO PER GHIACCIO

Organizzazione del Laboratorio di Biologia Molecolare Divisione delle aree di lavoro Area 1 Stoccaggio e Preparazione reattivi Area 1 Stoccaggio e Preparazione reattivi Area 2 Preparazione del campione Area 2 Preparazione del campione Area 3 Assemblaggio della Mix PCR Area 3 Assemblaggio della Mix PCR Area 4 Analisi dei prodotti di PCR Area 4 Analisi dei prodotti di PCR

Precauzioni da adottare nell’utilizzo di quest’area: Utilizzare solo la strumentazione e i reagenti conservati nell’areaUtilizzare solo la strumentazione e i reagenti conservati nell’area Effettuare una accurata pulizia del banco/cappa di lavoro prima e dopo l’usoEffettuare una accurata pulizia del banco/cappa di lavoro prima e dopo l’uso Esporre il banco/cappa di lavoro ad illuminazione UV O.N. al termine del lavoro di tutti gli operatoriEsporre il banco/cappa di lavoro ad illuminazione UV O.N. al termine del lavoro di tutti gli operatori Autoclavare periodicamente le pipette per evitare sia la degradazione degli acidi nucleici da parte delle RNAse e DNAse che un eventuale contaminazione da carry-overAutoclavare periodicamente le pipette per evitare sia la degradazione degli acidi nucleici da parte delle RNAse e DNAse che un eventuale contaminazione da carry-over Per evitare la degradazione del campione di mRNA e l’inattivazione degli enzimi, si raccomanda di porre le aliquote in ghiaccio.Per evitare la degradazione del campione di mRNA e l’inattivazione degli enzimi, si raccomanda di porre le aliquote in ghiaccio. Per evitare la degradazione del campione di mRNA è necessario l’uso di reagenti RNAse-freePer evitare la degradazione del campione di mRNA è necessario l’uso di reagenti RNAse-free Organizzazione del Laboratorio di Biologia Molecolare Regolamentazione delle aree di lavoro

Descrizione del lavoro effettuabile in quest’area: Preparazione della soluzione da stoccarePreparazione della soluzione da stoccare Preparazione delle aliquote della soluzionePreparazione delle aliquote della soluzione Preparazione di Master Mix (mix contenente tutti i reagenti tranne gli acidi nucleici da testare e gli enzimi termolabili)Preparazione di Master Mix (mix contenente tutti i reagenti tranne gli acidi nucleici da testare e gli enzimi termolabili) Area di Conservazione dei reagenti

Area di Preparazione dei Campioni Descrizione del lavoro effettuabile in quest’area: Preparazione del campione da testare (isolamento della popolazionePreparazione del campione da testare (isolamento della popolazione cellulare di interesse) Estrazione degli acidi nucleici (DNA, RNA)Estrazione degli acidi nucleici (DNA, RNA) Validazione quantitativa e qualitativa degli acidi nucleici estrattiValidazione quantitativa e qualitativa degli acidi nucleici estratti Stoccaggio degli Acidi NucleiciStoccaggio degli Acidi Nucleici

Area di Preparazione della PCR Descrizione del lavoro effettuabile in quest’area: Preparazione della reazione di Retrotrascrizione :Preparazione della reazione di Retrotrascrizione : a)Denaturazione del mRNA b)Assemblaggio della Master Mix RT (aggiunta dell’enzima RT e RNAsin e dell’acido nucleico) Preparazione della reazione di PCR:Preparazione della reazione di PCR: a)Assemblaggio della Master Mix PCR (aggiunta dell’enzima TaqPol e del cDNA diluito)

Area di Analisi del prodotto di PCR Precauzioni da adottare nell’utilizzo di quest’area: Le pipette utilizzate in quest’area non devono mai essere trasportate nelle aree precedentiLe pipette utilizzate in quest’area non devono mai essere trasportate nelle aree precedenti L’operatore deve adottare le opportune misure di sicurezza nel maneggiare sostanze mutagene (es: etidio-bromuro, isotopi radioattivi) e tossiche (es: acrilamide) e nell’utilizzo di strumentazioni ad UVL’operatore deve adottare le opportune misure di sicurezza nel maneggiare sostanze mutagene (es: etidio-bromuro, isotopi radioattivi) e tossiche (es: acrilamide) e nell’utilizzo di strumentazioni ad UV

Area di Analisi del prodotto di PCR Descrizione del lavoro effettuabile in quest’area: Le tecniche di analisi del prodotto di PCR variano in base al livello di sensibilità: 1.Elettroforesi su gel di Agarosio 2.Elettroforesi su gel di Acrilamide (denaturante/non denaturante) 3.Metodi di Ibridazione (Radioattivi/non radioattivi): Fase Solida (Dot-blot; Southern Blot) Fase Liquida (ELISA) 4.Metodi di Sequenziamento (Radioattivi/non radioattivi)

Sensibilità dell’analisi L’alta sensibilità delle tecniche utilizzate in un laboratorio di Biologia Molecolare Clinica, è influenzata da una serie di variabili: Variabili PreanaliticheVariabili Preanalitiche Variabili AnaliticheVariabili Analitiche

Variabili Preanalitiche 1)Valutazione della modalità di raccolta del campione 2)Isolamento della frazione cellulare di interesse 3)Stabilizzazione del campione 4)Conservazione del campione

Variabili Preanalitiche 1) Valutazione della modalità di raccolta del campione In un sistema di raccolta “aperto” (es: raccolta di urine, secrezioni) evitare la contaminazione con capelli, pelle e saliva dell’operatoreIn un sistema di raccolta “aperto” (es: raccolta di urine, secrezioni) evitare la contaminazione con capelli, pelle e saliva dell’operatore I campioni di sangue midollare e periferico sono raccolti in provette contenenti EDTA ( l’uso di eparina come anticoagulante può inibire la reazione di PCR) I campioni di sangue midollare e periferico sono raccolti in provette contenenti EDTA ( l’uso di eparina come anticoagulante può inibire la reazione di PCR) 2) Isolamento della frazione cellulare di interesse: Es: le cellule nucleate di un campione di sangue periferico o midollare possono essere isolate o mediante Buffer di Lisi (lisi degli eritrociti e successivo recupero delle cellule nucleate dopo centrifugazione) o mediante Centrifugazione in Gradiente di Densità (stratificazione del campione su Ficoll) Es: le cellule nucleate di un campione di sangue periferico o midollare possono essere isolate o mediante Buffer di Lisi (lisi degli eritrociti e successivo recupero delle cellule nucleate dopo centrifugazione) o mediante Centrifugazione in Gradiente di Densità (stratificazione del campione su Ficoll)

Variabili Preanalitiche 3) Stabilizzazione del campione Tale fase è essenziale per inibire la degradazione degli acidi nucleici Tale fase è essenziale per inibire la degradazione degli acidi nucleici L’uso di sostanze caotropiche (es: Guanidina Isotiocianato, Fenolo) inattiva le DNAse e le RNAse. L’uso di sostanze caotropiche (es: Guanidina Isotiocianato, Fenolo) inattiva le DNAse e le RNAse. 4) Conservazione del campione I campioni da processare per analisi del DNA devono essere conservati in buffer TE (contenente TRIS ed EDTA) a 4°C I campioni da processare per analisi del DNA devono essere conservati in buffer TE (contenente TRIS ed EDTA) a 4°C I campioni da processare per analisi del mRNA devono essere conservati in buffer contenente GTC, a -80°C I campioni da processare per analisi del mRNA devono essere conservati in buffer contenente GTC, a -80°C

Variabili Analitiche 1) Variabili associate alla preparazione del campione 2) Variabili associate alla sintesi del cDNA 3) Variabili associate alla reazione di PCR 4) Variabili associate all’analisi del campione processato

Variabili Analitiche 1) Variabili associate alla preparazione del campione Isolamento del DNA: Isolamento del DNA: a) Effettuare una completa rimozione di agenti inibenti la fase analitica (eme, prodotti di degradazione, eparina, fenolo) Isolamento del RNA: Isolamento del RNA: a) Effettuare una completa rimozione di agenti inibenti la fase analitica (eme, eparina) b) Completa inattivazione delle RNAse c) Valutazione della qualità del campione di mRNA (eventuale degradazione)

Variabili Analitiche 2) Variabili associate alla sintesi del cDNA L’efficienza della fase di retotrascrizione dipende da: L’efficienza della fase di retotrascrizione dipende da: Attività intrinseca dell’enzima RT Attività intrinseca dell’enzima RT Presenza di inibitori della RT (eme, fenolo) Presenza di inibitori della RT (eme, fenolo) Degradazione del mRNA Degradazione del mRNA Contaminazione del campione di mRNA con DNA genomico Contaminazione del campione di mRNA con DNA genomico Metodica di priming utilizzata (Oligo-dT priming, Random priming, Target Specific mRNA priming) Metodica di priming utilizzata (Oligo-dT priming, Random priming, Target Specific mRNA priming)

3) Variabili associate alla reazione di PCR Inibitori derivanti dalla fase pre-analitica (es: eparina) Inibitori derivanti dalla fase pre-analitica (es: eparina) Inappropriata temperatura di annealing Inappropriata temperatura di annealing Concentrazione subottimale di MgCl 2 Concentrazione subottimale di MgCl 2 Contaminazione dei campioni o dei reagenti Contaminazione dei campioni o dei reagenti a) Fonti di contaminazioni in fase pre-analitica (acidi nucleici non propri del campione) b) Fonti di contaminazione in fase analitica (cross-contaminazione di campioni processati nella stessa seduta; contaminazione dei reagenti e del materiale di uso) Variabili Analitiche

4) Variabili associate all’analisi del campione processato Interferenze nella corsa elettroforetica possono dipendere: Interferenze nella corsa elettroforetica possono dipendere: a) da caratteristiche proprie del gel e del tampone (concentrazione, forza ionica, pH). b) da inappropriata preparazione del campione (alta concentrazione di sali) c) da un corretto utilizzo degli agenti che consentano la visualizzazione del prodotto processato Interferenze nella digestione degli acidi nucleici possono dipendere: Interferenze nella digestione degli acidi nucleici possono dipendere: a) dalla opportuna concentrazione dell’enzima da utilizzare per la digestione b) dall’attività intrinseca dell’enzima (fortemente termosensibile) c) dalla concentrazione salina della soluzione in cui avviene la reazione Variabili Analitiche

4) Variabili associate all’analisi del campione processato Interferenze associate al blotting degli acidi nucleici:Interferenze associate al blotting degli acidi nucleici: a) Ridotta/Assente capacità della membrana di legare gli acidi nucleici Interferenze associate all’ibridazione:Interferenze associate all’ibridazione: a) Inapproriato metodo di marcatura b) Inapproriato metodo di ibridazione c) Inapproriato metodo di lavaggio Interferenze associate al sequenziamentoInterferenze associate al sequenziamento a)Non corretta copia dello stampo dell’acido nucleico da parte della TaqPol b)Cattiva qualità del templato c)Reagenti del sequenziamento non appropriati d)Bassa specificità dei primer Variabili Analitiche

Controlli di Qualità Controlli di qualità interni a) Controlli legati alla preparazione del materiale da testare b) Controlli legati alla reazione di RT-PCR c) Controlli per la valutazione dei risultati del test Controlli di qualità esterni Standardizzazione delle fasi preanalitiche ed analitiche

Controlli di Qualità Interni Controlli legati alla preparazione del materiale da testareControlli legati alla preparazione del materiale da testare a) La qualità degli acidi nucleici da testare può essere valutata mediante elettroforesi e lettura spettofotometrica a 260nm e 280nm b) La digestione del campione di DNA mediante enzimi di restrizione può essere visualizzata mediante corsa elettroforetica Controlli legati alla reazione di RT-PCRControlli legati alla reazione di RT-PCR a) Controlli negativi per escludere la presenza di contaminazioni b) Controlli positivi per escludere la presenza di eventuali inibitori nel campione e nella mix dei reagenti Controlli per la valutazione dei risultati del testControlli per la valutazione dei risultati del test a) Il prodotto di PCR è validato mediante corsa elettroforetica su gel di Agarosio o Acrilammide (in base alla risoluzione richiesta) confrontando l’altezza della banda con quelle di un Marcatore di Peso Molecolare noto b) L’analisi di sequenziamento deve essere effettuata oltre che sul campione da testare, anche su un controllo wt