Cromatografia (dal greco: chroma, colore + graphein, scrivere) Presentazione a cura di Rita Barra matr: 574/390Presentazione a cura di Rita Barra matr: 574/390

Cromatografia Il termine cromatografia indica un insieme di tecniche che hanno lo scopo di separare una soluzione nei suoi componenti, per permetterne il riconoscimento qualitativo e quantitativo Queste tecniche sono basate sulla distribuzione differenziale dei vari componenti fra due fasi, una chiamata fase fissa o fase stazionaria e l’altra chiamata fase mobile o eluente, che fluisce in continuo attraverso la fase fissa I metodi per separare le proteine sfruttano le seguenti caratteristiche chimico-fisiche: Carica, dimensioni, solubilità, affinità di legame con altre proteine.

Premesse Le tecniche cromatografiche sono sempre distruttive (anche se in senso strettamente analitico possono in alcuni casi essere non distruttive), in quanto operano esclusivamente su campioni in soluzione o in fase vapore e i materiali oggetto di analisi vanno quindi disciolti in un opportuno solvente. E’ bene ricordare che la cromatografia a scopo analitico richiede un consumo minimo di campione,da 1 ml a 1 µl di soluzione,(corrispondenti a pochi mg di campione solido),mentre la cromatografia a scopo preparativo richiede maggiori quantità di campione.

Fasi del procedimento cromatografico 1.il campione è introdotto nella fase mobile, che può essere un gas, un liquido o un fluido supercritico 2.la fase mobile viene fatta eluire di continuo attraverso la fase stazionaria, che deve essere immiscibile con l’eluente la fase stazionaria (liquida o solida) si trova all’interno di una colonna oppure è supportata su una superficie pianala fase stazionaria (liquida o solida) si trova all’interno di una colonna oppure è supportata su una superficie piana la fase mobile e la fase stazionaria sono scelte in modo che i componenti della miscela da separare si distribuiscano secondo le seguenti modalità:la fase mobile e la fase stazionaria sono scelte in modo che i componenti della miscela da separare si distribuiscano secondo le seguenti modalità: i componenti più affini alla fase stazionaria passeranno più tempo in questa fase, quindi si sposteranno più lentamente attraverso il sistemai componenti più affini alla fase stazionaria passeranno più tempo in questa fase, quindi si sposteranno più lentamente attraverso il sistema i componenti più affini alla fase mobile si sposteranno invece più velocementei componenti più affini alla fase mobile si sposteranno invece più velocemente N.B.: la separazione dei componenti avviene basandosi sul principio che ogni sostanza si distribuisce tra le due fasi secondo la sua specifica costante di ripartizione K d =C s /C m Dove: C s =concentrazione dell’analita nella fase stazionaria C m =concentrazione dell’analita nella fase mobile C m =concentrazione dell’analita nella fase mobile

Visualizzazione della separazione IL cromatogramma è uno strumento matematico che ci consente di visualizzare i dati biologici derivati dalla cromatografia e di interpretarli. In particolare è un grafico che si ottiene ponendo in relazione i parametri: a)concentrazione del soluto nell’eluato, cioè la fase mobile che esce dalla colonna (misurata da un rivelatore posto all’uscita della colonna), posta sull’asse y e b) il tempo, posto sull’asse x. Per tempo di ritenzione (t R ) si intende la posizione dei picchi sull’asse dei tempi, e serve per identificare i componenti del campione (esistono tabelle che riportano i t R degli standards). Per ampiezza dei picchi (W) si intende l’area sottesa dai picchi,che è proporzionale alla quantità di ogni singolo componente e può essere utilizzata a scopo quantitativo.

Tempo di ritenzione Il tempo di ritenzione t R,diverso per ciascuna sostanza,costituisce il parametro qualitativo dell’analisi cromatografica ed è il tempo che impiega un componente della soluzione iniettata ad essere rivelato come picco dal detector. In figura è rappresentato un cromatogramma schematico di una soluzione adue componenti, utile per comprendere le due principali modalità di interazione soluto-fase stazionaria: il picco a sinistra rappresenta un soluto che non ha alcuna interazione con la fase stazionaria ed esce al cosiddetto tempo morto, t Mil picco a sinistra rappresenta un soluto che non ha alcuna interazione con la fase stazionaria ed esce al cosiddetto tempo morto, t M il picco a destra rappresenta un soluto che ha, invece, interazione con la fase stazionaria ed esce al tempo t R > t Mil picco a destra rappresenta un soluto che ha, invece, interazione con la fase stazionaria ed esce al tempo t R > t M

Tempo di ritenzione E’ possibile quantificare l’interazione di un soluto con la fase stazionaria in due modi: mediante la formula: V R = t R x Fmediante la formula: V R = t R x F Dove: Dove: V R =volume di fase mobile necessario per eluire il soluto V R =volume di fase mobile necessario per eluire il soluto F = velocità di flusso F = velocità di flusso mediante la formula:mediante la formula: Dove: Dove: K’= fattore di capacità espresso come la differenza tra il tempo di ritenzione ed il tempo morto in unità di tempo morto (K’=quantità di materiale che può essere risolto senza che si abbia sovrapposizione dei picchi). K’= fattore di capacità espresso come la differenza tra il tempo di ritenzione ed il tempo morto in unità di tempo morto (K’=quantità di materiale che può essere risolto senza che si abbia sovrapposizione dei picchi).

Piatti effettivi Per descrivere il processo cromatografico si può utilizzare una similitudine con il processo di distillazione. Si considera la colonna cromatografica simile ad una colonna di distillazione, cioè composta da una serie di strati sottili o microelementi chiamati piatti effettivi, in ognuno dei quali si realizza l’equilibrio di distribuzione del soluto tra fase stazionaria e fase mobile. Tale quantità adimensionale,detta anche Neff, riflette il numero di volte in cui il solvente si riparte fra le due fasi durante il suo passaggio attraverso la colonna. I parametri numero di piatti effettivi (N) e altezza del piatto (HETP, Height Equivalent to Theoric Plate) sono comunemente utilizzati in cromatografia per quantificare le prestazioni dei sistemi cromatografici

Numero di piatti effettivi o di Neff Tale parametro fornisce un’indicazione del buon impaccamento della colonna ed è rappresentato dalla seguente formula: Dove: L = lunghezza della colonna H = altezza del piatto T’r =tempo di eluizione del centro della banda  = varianza della banda in unità di tempo Poiché Wb =ampiezza della base del picco =4  Da cui:

Altezza del piatto Tale parametro è la distanza che il soluto deve percorrere mentre si realizza una partizione ed è rappresentato dalla seguente formula:

Risoluzione cromatografica Il successo di ogni tecnica cromatografica sta nella capacità di separare completamente (risolvere) un analita a partire da una soluzione di composti simili. La risoluzione del picco (Rs) è descritta dalle proprietà del picco, in particolare: Dove: tRa e tRb= tempi di ritenzione per i composti a e b Wa e Wb =larghezze alla base dei picchi a e b

Separazione ottimale a)separazione con scarsa risoluzione e basso numero di piatti teorici b)migliore risoluzione ma sempre basso il numero di piatti teorici c)ottima risoluzione e buono numero di piatti teorici Per Rs= 1,5 la separazione dei due picchi è completa al 99,7% Nella pratica si considerano accettabili valori di Rs pari a 1, relativi ad una separazione del 98%, ammesso che la sensibilità del sistema di rivelazione i due composti sia simile.

Interazione soluto-fasi Le interazioni che si sfruttano a scopo separativo tra le sostanze da separare e le due fasi (mobile e stazionaria) sono deboli, al fine di consentire i fenomeni di trattenimento sulla fase stazionaria oppure, al contrario, di eluizione. In particolare le interazioni deboli principali sono: legami a idrogenolegami a idrogeno interazioni dipolo-dipolointerazioni dipolo-dipolo interazioni dipolo-dipolo indottointerazioni dipolo-dipolo indotto forze di Van der Waalsforze di Van der Waals formazione di composti di interazioneformazione di composti di interazione attrazione coulombianaattrazione coulombiana interazioni stericheinterazioni steriche In tutte queste interazioni svolge un ruolo solitamente decisivo la polarità delle due fasi. Spesso possono essere presenti più tipi di interazione nello stesso processo cromatografico.

Meccanismi della separazione In base ai tipi di interazione soluto-fase stazionaria che prevalgono nel processo cromatografico, possiamo suddividere i meccanismi di separazione impiegati in cromatografia in: 1.adsorbimento 2.ripartizione 3.scambio ionico 4.esclusione 5.affinità

Adsorbimento La cromatografia di adsorbimento può essere gas-solido o liquido- solido a seconda della natura della fase mobile. La fase stazionaria è un solido in polvere steso su un supporto; sulla superficie dei granuli si trovano siti attivi che possono stabilire legami deboli (reversibili!) con le molecole della soluzione da separare. La fase stazionaria è un solido in polvere steso su un supporto; sulla superficie dei granuli si trovano siti attivi che possono stabilire legami deboli (reversibili!) con le molecole della soluzione da separare. La cromatografia di adsorbimento è utilizzata per separare sostanze neutre polari o non polari, di natura organica o inorganica

Ripartizione La cromatografia di ripartizione, che può essere gas-liquido o liquido-liquido a seconda della natura della fase mobile. In generale la fase stazionaria è un liquido che impregna un solido granulare inerte o ad esso chimicamente legato e in cui le molecole da separare sono solubili; la fase stazionaria e la fase mobile devono invece essere immiscibili. Durante l’eluizione le molecole si ripartiscono dinamicamente tra le due fasi in base alla diversa solubilità di ognuna. La cromatografia di ripartizione è chiamata in fase normale se la fase stazionaria è più polare della fase mobile, mentre è chiamata fase inversa se la fase stazionaria è meno polare della fase mobile. E’ la tecnica più comunemente impiegata per la separazione di sostanze organiche.

Scambio ionico Nella cromatografia di scambio ionico (IEC) la fase stazionaria è costituita da un polimero inerte contenente siti attivi ionizzati o ionizzabili, i cui controioni possono essere scambiati con altri ioni aventi carica dello stesso segno. Il meccanismo di separazione è basato sulla competizione per i siti di scambio tra gli ioni presenti nella fase mobile e quelli presenti nel campione. La cromatografia a scambio ionico è impiegata per la separazione di sostanze ioniche o ionizzabili. Le resine possono essere scambiatrici di: Cationi:la matrice contiene gruppi carbossimetilici a carica negativaCationi:la matrice contiene gruppi carbossimetilici a carica negativa e ad essa si legano proteine con carica positiva (pH<pI). Anioni:la matrice contiene gruppi DEAE a carica positiva e ad essa siAnioni:la matrice contiene gruppi DEAE a carica positiva e ad essa si legano proteine a carica negativa (pH>pI).

Esclusione dimensionale La cromatografia di esclusione dimensionale (SEC) esiste nelle varianti Gel permeazione per la separazione di sostanze insolubili in acqua e Gel filtrazione per la separazione di sostanze solubili in acqua. La fase stazionaria è un solido poroso o un gel. Le molecole dell’analita, disciolte nella fase mobile, penetrano nei pori se le loro dimensioni sono compatibili e vi rimangono per un certo tempo, se invece sono di dimensioni maggiori vengono escluse dai pori ed escono dalla colonna in tempi brevi. Tale tecnica è impiegata per la separazione di molecole di grandi dimensioni.

Affinità Nella cromatografia di affinità (AFC) si utilizzano reazioni di tipo biochimico, reversibili e molto specifiche, in modo che le molecole da separare interagiscano con la fase stazionaria e si ottenga così l’eluizione selettiva di alcuni componenti della soluzione. La cromatografia di affinità è impiegata nella separazione di molecole di interesse prevalentemente biochimico La tecnica prevede che il composto da purificare si leghi reversibilmente a un ligando specifico, immobilizzato su una matrice insolubile (cellulosa, destrano, agarosio, poliacrilammide, vetro poroso) :La tecnica prevede che il composto da purificare si leghi reversibilmente a un ligando specifico, immobilizzato su una matrice insolubile (cellulosa, destrano, agarosio, poliacrilammide, vetro poroso) : Nel caso di un enzima, il ligando può essere rappresentato dal substrato, da un inibitore reversibile o da un attivatore.Nel caso di un enzima, il ligando può essere rappresentato dal substrato, da un inibitore reversibile o da un attivatore.

Stato fisico della fase mobile 1.Cromatografia Liquida (LC): la fase mobile è un liquido nel quale sono solubili i componenti della soluzione da separare;la fase stazionaria deve essere insolubile nella fase mobile;adatta per sostanze non volatili e sostanze termolabili. 2.Gascromatografia (GC): la fase mobile è un gas che funge da carrier per i componenti della miscela. 3.Cromatografia fluida supercritica (SFC): la fase mobile è un fluido supercritico, con proprietà intermedie tra un liquido e un gas. In base allo stato fisico della fase mobile possiamo classificare le tecniche cromatografiche in 3 tipologie:

Forma del letto cromatografico 1.Cromatografia su colonna: la fase stazionaria è all’interno di una colonna cilindrica, e può riempirla completamente (colonna impaccata) oppure rivestirne la superficie interna (colonna tubulare). 2.Cromatografia planare: la fase stazionaria è distribuita su una superficie piana, che può essere un supporto cartaceo (cromatografia su carta, PC) o una lastrina di vetro o di altro materiale (cromatografia su strato sottile, TLC). La forma del letto cromatografico su cui si realizza il processo separativo, è un altro parametro utile per distinguere 2 tipologie di cromatografia :

Tecniche cromatografiche 1.In base al meccanismo di separazione AdsorbimentoAdsorbimento RipartizioneRipartizione Scambio ionicoScambio ionico EsclusioneEsclusione AffinitàAffinità 2.In base allo stato fisico della fase mobile Cromatografia Liquida (LC)Cromatografia Liquida (LC) Gascromatografia (GC)Gascromatografia (GC) Cromatografia fluida supercritica (SFC)Cromatografia fluida supercritica (SFC) 3. In base alla forma del letto cromatografico Cromatografia su colonna (impaccata, open-tubular)Cromatografia su colonna (impaccata, open-tubular) Cromatografia planare (su carta, su strato sottile)Cromatografia planare (su carta, su strato sottile) Schematicamente è possibile distinguere 3 tipi di classificazione delle tecniche cromatografiche: