Corso di Biochimica clinica Le proteine plasmatiche Prof. Giuseppe Castaldo, a.a. 2015-16

Proteine Funzioni dinamiche Funzioni statiche trasporto controllo metabolico catalisi delle reazioni enzimatiche Funzioni statiche matrici proteiche del tessuto osseo e del tessuto connettivo

Nel plasma sono contenuti Produzione delle proteine plasmatiche Nel plasma sono contenuti 6-8 g/dl di proteine

Proteine totali Aumento delle gamma (mono o policlonale) Prima di dosare specifiche proteine, il laboratorio di biochimica misura le concentrazioni di “proteine totali” in un campione di siero. Le variazioni nella concentrazione totale di proteine sono frequenti Aumento delle gamma (mono o policlonale) Disidratazione o emoconcentrazione Cambiamenti posturali Proteine abnormi Bassa concentrazione di albumina Iperidratazione (gravidanza) Diminuita sintesi Perdita renale, intestinale, nelle ferite o nelle ustioni

Elettroforesi delle proteine plasmatiche Le principali frazioni proteiche vengono separate in base alla loro diversa velocità di migrazione su gel (di acetato di cellulosa o di agarosio) A 1 2   Albumina 1-antitripsina Immunoglobuline 2-macroglobulina aptoglobina Transferrina C3 del complemento

Ogni frazione può contenere molte proteine diverse

Quadro proteico elettroforetico (PQ) Albumina 3.5 – 5.4 g/dL a1 0.2 – 0.4 g/dL a2 0.5 – 0.9 g/dL b 0.6 – 1.1 g/dL g 0.8 – 1.5 g/dL

Albumina È la proteina più abbondante della frazione sieroproteica Valori di riferimento: 3,6-4,9 g/dl È la proteina più abbondante della frazione sieroproteica L’ipoalbuminemia è responsabile di ipoprotidemia, poiché l’albumina costituisce da sola il 55-64% delle proteine plasmatiche totali Le funzioni principali sono: il mantenimento della pressione osmotica del sangue Il trasporto di acidi grassi, bilirubina, ormoni e farmaci Insufficiente apporto Ridotto assorbimento Perdita Ridotta sintesi Ipercatabolismo Emodiluizione Emoconcentrazione Infusione di albumina

Le 4 cause principali che derminano abbassamento della concentrazione di albumina plasmatica…. Tra le funzioni dell'albumina rientrano:•mantenere la pressione oncotica•trasportare gli ormoni della tiroide•trasportare gli altri ormoni, in particolare quelli solubili nei grassi (liposolubili)•trasportare gli acidi grassi liberi•trasportare la bilirubina non coniugata•trasportare molti farmaci•legarsi competitivamente agli ioni calcio (Ca2+)•tamponare il pHCause delle carenze di albumina:•cirrosi del fegato (è la causa più comune)•diminuita produzione (come nel caso della denutrizione)•eccesso di secrezione dei reni (come nelle nefriti)•eccesso di secrezione nell'intestino (enteropatia)

1) Distribuzione anomala l’albumina può distribuirsi nello spazio interstiziale per effetto di un’aumentata permeabilità capillare, nella risposta alla fase acuta (in presenza di citochine infiammatorie, Tumor necrosis factor, interleuchine..)

2) Sintesi diminuita Può essere dovuta a malnutrizione, malassorbimento, malattia epatica cronica nello stadio avanzato Profilo normale Cirrosi

3) Diluizione Si può generare un’ipoalbuminemia per effetto di una sovraidratazione, Es., in condizioni parafisiologiche come gravidanza e allattamento per effetto della ipervolemia

4) Escrezione anomala o degradazione Tra le cause principali ci sono la compromissione renale, ustioni, enteropatia con perdita di proteine, ferite, emorragia, stati catabolici

Alfa1-globuline Valori di riferimento: 0,2-0,4 g/dl Tale frazione elettroforetica esprime principalmente il comportamento dell’1-glicoproteina, dell’1-fetoproteina, dell’1-lipoproteina Gravidanza Malattie infettive Malattie infiammatorie croniche Infarto del miocardio Neoplasie Carenza congenita di 1-antitripsina Sclerodermia Sindrome nefrosica

Alfa1-globuline Valori di riferimento: 0,2-0,4 g/dl Tale frazione elettroforetica esprime principalmente il comportamento dell’1-glicoproteina, dell’1-fetoproteina, dell’1-lipoproteina Gravidanza Malattie infettive Malattie infiammatorie croniche Infarto del miocardio Neoplasie Carenza congenita di 1-antitripsina Sclerodermia Sindrome nefrosica

Deficit di Alfa1-antitripsina Valori di riferimento: 0,8-2 g/L Importante inibitore delle proteasi e delle elastasi dei neutrofili  nell’infiammazione e nella necrosi dei tessuti Deficit di Alfa1-antitripsina Si può manifestare con: Epatite neonatale Epatite cronica con negatività dei marker Cirrosi epatica nell’adulto Enfisema polmonare nella seconda-terza decade di età OMOZIGOSI per l’allele Z (diminuzione del 15%) Si può manifestare con  suscettibilità a malattie polmonari ETEROZIGOSI (diminuzione del 60%)

Aumento di Alfa1-fetoproteina Valori di riferimento: <5 mg/L È presente nei tessuti e nel plasma del feto, la sua concentrazione cala dopo la nascita  in gravidanza Aumento di Alfa1-fetoproteina Epatocarcinoma Teratoma testicolare Nel liquido amniotico e nel siero materno: Anencefalia Spina bifida Diminuzione di Alfa1-fetoproteina Trisomia del cromosoma 21 (Sindrome di Down)

Alfa2-globuline Valori di riferimento: 0,4-0,8 g/dl Tale frazione elettroforetica esprime principalmente il comportamento dell’2-macroglobulina, dell’aptoglobina, dell’antitrombina III, protrombina, ceruloplasmina, colinesterasi, pre--lipoproteine Infezioni acute batteriche Traumi Interventi chirurgici Infarto del miocardio Neoplasie Epatopatie croniche Diabete mellito Sindrome di Down Epatite virale Collagenopatie Pancreatite

Alfa2-macroglobulina È un potente inibitore delle proteasi Valori di riferimento: 1,5-4 g/L È un potente inibitore delle proteasi Costituisce circa 1/3 delle alfa 2 globuline Sindrome nefrosica, per ritenzione selettiva legata alle dimensioni molecolari Gravidanza (circa del 20% in più) Età senile Fase acuta dell’infiammazione Pancreatiti Carcinoma della prostata, perché si lega al PSA

Ceruloplasmina Veicola il rame Valori di riferimento: 0,2-0,4 g/L Gravidanza Assunzione di anticoncezionali Infezioni acute Neoplasie (leucemie) Morbo di Wilson

Beta-globuline Valori di riferimento: 0,6-1 g/dl Tale frazione elettroforetica esprime principalmente il comportamento della transferrina, C3, proteina C reattiva, 2-microglobulina, -lipoproteine, Ig Talora è possibile osservare uno sdoppiamento in frazioni 1 e 2 1: transferrina, comlpemento e Ig 2: microglobuline, lipoproteine e IgM Gravidanza Cirrosi epatica Sindrome nefrosica A-beta-lipoproteinemia congenita Atransferrinemia congenita Enteropatie essudative

Transferrina 1: transferrina Valori di riferimento: 3-3,5 g/L Quando l’elettroforesi viene realizzata in un tampone contenente ioni Ca++ È possibile osservare uno sdoppiamento in frazioni 1 e 2 1: transferrina È deputata al trasporto del ferro nel plasma, ai siti di deposito (fegato e cellule reticolo-endoteliali). Il complesso Fe-transferrina è legato da recettori posti sulla membrana cellulare, viene internalizzato e scisso Sindromi protidodisperdenti Anemie (per neoplasia): poiché il complessoFe-transferrina viene captato dal sistema reticolo-endoteliale Epatopatie: per diminuzione della sintesi epatica Stati ferrocarenziali Gravidanza Terapia estro-progestinica

Frazione C3 del Complemento Valori di riferimento: 3-3,5 g/L Quando l’elettroforesi viene realizzata in un tampone contenente ioni Ca++ È possibile osservare uno sdoppiamento in frazioni 1 e 2 2: C3 Con il termine di Complemento si comprendono un insieme di proteine, alcune delle quali con attività� enzimatica, che insieme agli Anticorpi svolgono un ruolo di primaria importanza nei meccanismi di difesa dell’immunit�à umorale. Malattie autoimmuni Anemia emolitica, perché si determina consumo del complemento Epatiti Blocco del suo catabolismo in cirrosi biliare primitiva, Colestasi grave Fase acuta (dopo 5-6 giorni)

Il complemento �è costituito da una ventina di proteine circolanti capaci di interagire con le membrane biologiche e con specifici recettori situati sulla superficie di diversi tipi cellulari, hanno la capacità� di opsonizzare i patogeni e di indurre una serie di reazioni infiammatorie che aiutano a combattere le infezioni. Ci sono tre distinte vie attraverso cui il complemento pu�ò essere attivato sulla superficie dei patogeni: la via classica, la via MB-lectin (mannan-binding lectin) e la via alternativa. Le tre vie convergono in una via finale comune che porta alla attivazione del complesso di attacco alla membrana o MAC (membrane attack complex) costituita da una struttura multiproteica lipofila a forma di poro che provoca la lisi cellulare.

Variazioni del C3 Aumenti del C3 Reazioni della fase acuta Ostruzione biliare e cirrosi biliare Glomerulosclerosi focale (30% dei pazienti) Diminuzione del C3 Deficit genetico Glomerulonefrite post-streptococcica Malattie del collagene Anemie autoimmuni Epatite Batteriemie

Gamma-globuline Comprendono le Immunoglobiline (G, M, A, D, E) Valori di riferimento: 0,9-1,4 g/dl Comprendono le Immunoglobiline (G, M, A, D, E) È un gruppo di proteine eterogenee che migrano principalmente nella zona  Costituiscono gli anticorpi umorali in grado di facilitare la distruzione degli antigeni estranei all’organismo da parte del sistema immunitario Sono sintetizzate e secrete dalle plasmacellule (derivanti dai linfo B) Poichè la frazione IgG, in condizioni normali, è prevalente sulle altre, la banda delle -globuline è rappresentata soprattutto dalle IgG

Un aumento delle -globuline può essere distinto nei quadri della gammopatia policlonale o monoclonale Policlonale: con aumento di molte classi di immunoglobuline Epatopatie croniche (epatite cronica, cirrosi epatica) Infezioni congenite Infezioni batteriche acute e croniche Parassitosi Monoclonale: con aumento di un unico tipo di immunoglobulina Malnutrizione Ustioni Terapia immunosoppressiva Sindrome nefrosica

Gammapatia policlonale La stimolazione di numerosi cloni di plasmacellule da parte di antigeni o virus epatotropi induce l’incremento di diverse classi di Immunoglobuline All’elettroforesi le gammapatie policlonali sono caratterizzate da un incremento diffuso ed eterogeneo della frazione In alcuni casi nelle malattie infettive si può avere aumento isolato di una classe di immunoglobuline, che non è diagnostico ma può contribuire alla diagnosi differenziale IgM: fase precoce di infezione IgG: contatto con un antigene già noto IgA: danno epatico (alcool, contraccettivi orali) globuline a

Gammapatia monoclonale globuline a Elettroforesi: Derivano da proliferazione clonale maligna o potenzialmente maligna (mentre i policlonali da processi infiammatori) Sono caratterizzate da: Iperproliferazione di un clone di cellule della linea linfocitaria B, in assenza di uno stimolo antigenico dimostrabile Sintesi di immunoglobuline omogenee per struttura e caratteristiche antigeniche Deficit a carico delle immunoglobuline normali globuline a Elettroforesi: Picco monoclonale a banda stretta

Ipogammaglobulinemia La concentrazione delle immunoglobuline aumenta progressivamente fin dalla nascita. La diminuzione della sintesi di immunoglobuline è clinicamente associata ad una ridotta resistenza alle infezioni. Si distinguono deficit immunitari: primitivi (globali o parziali) secondari (a infezioni, neoplasie, trattamento con farmaci, …) globuline a Elettroforesi: È facilmente riconoscibile quando riguarda le tre classi; il contrario se l’immunodeficienza è selettiva È quindi necessario integrare con altri esami, es: conteggio e classificazione in sottopopolazioni dei linfociti circolanti

Quantizzazione della Componente Monoclonale

Immunoelettroforesi per la tipizzazione di Componenti Monoclonali

L’elettroforesi multifrazionata permette una migliore separazione delle proteine

L’elettroforesi bidimensionale permette di separare un numero molto maggiore di proteine ma è una metodica utilizzata poco nella routine

Dosaggio di proteine specifiche Proteine di fase acuta Altre singole proteine dosate a scopo diagnostico

Proteine specifiche La misura di alcune proteine specifiche può fornire informazioni utili nella diagnosi e nel trattamento terapeutico Nome della proteina Funzione Scopo del dosaggio 1-antitripsina Inibitore delle proteasi Ridotta in caso di deficit dell’ 1antitripsina Ceruloplasmina Enzima ossidante Ridotta nel Morbo di Wilson Proteina C reattiva Coinvolta nella risposta immunitaria Aumenta nelle patologie acute, es. infezioni Aptoglobina Lega l’emoglobina Ridotta in condizioni di emolisi 2-microglobulina Subunità dell’antigene HLA Aumenta su tutte le membrane cellulari in caso di disfunzione tubulare renale Ferritina Lega il ferro nei tessuti Fornisce indicazioni sulla riserva di ferro corporeo Transferrina Trasporto di ferro Valutazione sullo stato del ferro e/o risposta ad un apporto nutrizionale Globulina che lega la tirosina (TBG) Lega l’ormone tiroideo Ricerca sulle malattie della tiroide Globulina che lega l’ormone sessuale (SHBG) Lega testosterone ed estradiolo Ricerca sull’eccesso di androgeni e/o resistenza all’insulina

Proteine della fase acuta* Proteina C reattiva Amiloide A Alfa-1 antitripsina Alfa-1 glicoproteina acida Aptoglobina C3 e C4 Fase acuta: serie di risposte fisiologiche aspecifiche scatenate da un trauma, infezione, etc.

“proteine della fase acuta” Si possono osservare variazioni caratteristiche nella concentrazione di alcune proteine plasmatiche in seguito a intervento chirurgico, a trauma, durante processi infettivi o durante lo sviluppo di tumori. “proteine della fase acuta” La risposta delle proteine alla fase acuta è un aumento o una diminuzione della produzione (principalmente da parte del fegato) di alcune proteine citochine TNF Evento traumatico proteine della fase acuta Infiammazione

Aumentano nella fase acuta dell’infiammazione in ordine di tempo Proteina C reattiva A1antichimotripsina Aptoglobina A1glicoproteina acida A1antitripsina C4 Fibrinogeno C3 Ceruloplasmina I migliori indicatori della fase reattiva acuta sono le proteine che subiscono gli incrementi maggiori: aumenti moderati nelle infezioni virali, notevoli in quelle batteriche

Diminuiscono nella fase acuta dell’infiammazione Albumina Transferrina Poiché sono piccole proteine che passano al di fuori dei vasi per la maggiore permeabilità indotta dalla flogosi

La risposta delle proteine della fase acuta Tipo di proteina Aumento Diminuzione Inibitori delle proteasi 1-antitripsina 2-macroglobulina Proteine della coagulazione Fibrinogeno Protrombina Fattore VIII Plasminogeno Proteine C1s del complemento C2, B, C3, C4, C5, C56, C1 INH Varie Aptoglobulina Ceruloplasmina PCR Proteina A nel siero Albumina HDL LDL

Usi clinici delle proteine di fase acuta Il dosaggio di queste proteine può essere utilizzato per monitorare il progredire della patologia o l’effetto della terapia Misurando la Proteina C reattiva nel siero (PCR): la cui concentrazione cambia molto rapidamente, quindi può essere usata per il controllo giornaliero Valutando la velocità di sedimentazione degli eritrociti (VES): è una misura indiretta da fibrinogeno e delle immunoglobuline. Varia lentamente e viene utilizzata per seguire l’andamento del processo infiammatorio al passare delle settimane

Proteine della fase acuta: dosaggio nel tempo Nelle forme di natura non neoplastica l’aumento delle proteine di fase acuta è in genere brusco e limitato nel tempo Il riscontro di una reazione di fase acuta che si protrae nel tempo depone fortemente per un processo neoplastico

Proteina C reattiva Globulina pentamerica Attività opsonizzante Attiva il complemento

Proteina C reattiva Non va incontro a processi di sequestro e degradazione locali La sua cinetica corrisponde alla reale risposta biosintetica Molto sensibile Poco specifica per un singolo processo morboso In corso di infiammazione aumenta già alla 6a ora, raggiunge il picco tra 24 e 48 ore e rientra nella norma a 96 ore

Velocità di eritrosedimentazione (VES)

VES Diminuzione della VES (rallentamento) Policitemie Aumento della VES (accelerazione) Anemie Aumento delle proteine fibrose (proteine di fase acuta) La VES è quindi un test aspecifico e indiretto di fase acuta E’ un test sensibile ma poco specifico

Dosaggio delle Immunoglobuline IgM IgA IgG (e sottoclassi 1-4) IgD IgE

Dosaggio della Ferritina - Carenza di ferro + Danno epatico Sovraccarico di ferro

Transferrina sierica è una -globulina con funzione di trasporto del ferro ai comparti di deposito e al midollo È presente nel plasma in forma libera (due terzi del totale) ed in forma legata, ogni molecola lega 2 molecole di Fe+++ ( un terzo del totale) Quantità della proteina nel siero: 200-300 mg/dl Capacità totale di legare il ferro (TIBC): Transferrina sierica mg/dl x 1,25 la quota satura coincide con il valore della sideremia la quota insatura: TIBC - sideremia Gravidanza Anemie sideropeniche Età neonatale Età senile

Ferritina sierica 6 gr Equilibrio dinamico La ferritina è una proteina la cui composizione è estremamente eterogenea per cui si distinguono numerose forme isoenzimatiche tipiche di ogni tessuto Equilibrio dinamico Ferritina sierica 1 gr 6 gr Ferritine tessutali 5 gr La ferritina sierica contiene fino ad un massimo di 500 atomi di ferro per molecola origina dal tessuto reticolo-endoteliale ed è catabolizzata dal fegato La concentrazione è in rapporto ai depositi di ferro nell’organismo Marker tumorale Sindromi emolitiche Epatopatie Terapia con ferro Neoplasie Insufficiente apporto di ferro