AMMINOACIDI PEPTIDI PROTEINE 4

Classificazione degli Amminoacidi Anche se il nome implica la presenza di un gruppo amminico —NH2 e di un gruppo carbossilico —CO2H, in realtà sono presenti i gruppi —NH3+ and —CO2–. Sono classificati come a, b, g, ecc. ammino acidi in funzione del carbonio che porta la funzione ammonio 4

NH3 + CO2 – a + H3NCH2CH2CO2 – b + H3NCH2CH2CH2CO2 – g un a-amminoacido intermedio nella biosintesi dell’etilene a un b-amminoacido componente del coenzima A + H3NCH2CH2CO2 – b + H3NCH2CH2CH2CO2 – un g-amminoaacido coinvolto nella trasmissione dell’impulso nervoso g

Sono noti 700 amminoacidi naturali 20 ammino acidi, tutti a-amminoacidi, sono i componenti delle proteine. I 20 amminoacidi differiscono per il gruppo legato al carbonio a. C O – R H H3N +

C O – H H3N + Glicina (Gly or G) H O H O + + – – H3N C C O H3N C C O CH3 CH(CH3)2 Alanina Valina (Ala or A) (Val or V)

H O H O + – + – H3N C C O H3N C C O CH2CH(CH3)2 CH3CHCH2CH3 Leucina Isoleucina (Leu or L) H O (Ile or I) + – H3N C C O CH3SCH2CH2 Metionina (Met or M)

C O – CH2 H H2N + H2C C H2 C O – CH2 H H3N + Prolina (Pro or P) Fenilalanina (Phe or F)

C O – CH2 H H3N + N C O – H H3N + H2NCCH2 Asparagina (Asn or N) Triptofano (Trp or W)

C O – H H3N + H2NCCH2CH2 H O + – H3N C C O CH2OH Serina H O Glutammina (Ser or S) + – H3N C C O (Gln or Q) CH3CHOH Treonina (Thr or T)

C O – H H3N + OCCH2 C O – H H3N + OCCH2CH2 Acido Aspartico Acido Glutammico (Asp or D) (Glu or E)

C O – CH2 H H3N + OH H O + – H3N C C O H O + – CH2SH H3N C C O Cisteina CH2 NH N (Cys or C) Tirosina Istidina (Tyr or Y) (His or H)

H O H O + + – – H3N C C O H3N C C O + CH2CH2CH2CH2NH3 CH2CH2CH2NHCNH2 + NH2 Lisina Arginina (Lys or K) (Arg or R)

Stereochimica degli Amminoacidi 4

La Glicina è achirale. Tutti gli altri ammino acidi presenti nelle proteine hanno L-configurazione al carbonio a. H3N + H R CO2 –

Proprietà Acido-Base degli Amminoacidi 4

Proprietà della Glicina Alto punto di fusione (si decompone a 233°C) Solubilità in acqua consistente con – • • O H3NCH2C •• + O OH H2NCH2C •• • • zwitterione o ione dipolare

Tipico ione ammonio: pKa ~9 Tipico acido carbossilico: pKa ~5 O In soluzione fortemente acida, diciamo a pH = 1, la glicina esiste nella forma protonata. O OH H3NCH2C + •• • • Se si innalza il pH per aggiunta di una base quale protone sarà allontanato? Quello legato all’azoto o all’ossigeno? Basta confrontare i pKa Tipico ione ammonio: pKa ~9 Tipico acido carbossilico: pKa ~5 O OH H3NCH2C + •• • •

La forma neutra più stabile della glicina è lo ione dipolare – • • O H3NCH2C •• + Il pKa sperimentale della glicina è 2.34. L’acidità maggiore di quella di un tipico acido carbossilico si giustifica con l’azione elettronattrattrice stabilizzante del gruppo ammonio.

Incrementando il pH si può allontanare il protone legato all’azoto – • • O H3NCH2C •• + – • • O H2NCH2C •• HO – Il pKa per questo protone è 9.60.

Punto isoelettrico pI O OH H3NCH2C + •• • • Il pH a cui la concentrazione dello zwitterione è massima è chiamato punto isoelettrico. Il pI della glicina è 5,97. Questo valore è la media dei pKa. Al pI le concentrazioni delle forme anionica e cationica sono uguali pKa = 2.34 – • • O H3NCH2C •• + pKa = 9.60 – • • O H2NCH2C ••

Amminoacidi con catena neutra – H H3N + pKa1 = 2.34 pKa2 = 9.60 pI = 5.97 Glicina H3N C O – CH3 H + pKa1 = 2.34 pKa2 = 9.69 pI = 6.00 Alanina

H3N C O – CH(CH3)2 H + pKa1 = 2.32 pKa2 = 9.62 pI = 5.96 Valina H3N C O – CH2CH(CH3)2 H + pKa1 = 2.36 pKa2 = 9.60 pI = 5.98 Leucina H O pKa1 = 2.36 pKa2 = 9.60 pI = 5.98 + – Isoleucina H3N C C O CH3CHCH2CH3

H O pKa1 = 2.28 pKa2 = 9.21 pI = 5.74 + – Metionina H3N C C O CH3SCH2CH2 H2N C O – H + CH2 H2C C H2 pKa1 = 1.99 pKa2 = 10.60 pI = 6.30 Prolina

H3N C O – H + CH2 pKa1 = 1.83 pKa2 = 9.13 pI = 5.48 Fenilalanina H O pKa1 = 2.09 pKa2 = 9.10 pI = 5.60 + – Treonina H3N C C O CH3CHOH

H3N C O – H + CH2 N pKa1 = 2.83 pKa2 = 9.39 pI = 5.89 Triptofano H3N C O – CH2OH H + pKa1 = 2.21 pKa2 = 9.15 pI = 5.68 Serina

H3N C O – H + H2NCCH2CH2 pKa1 = 2.17 pKa2 = 9.13 pI = 5.65 Glutammina H O pKa1 = 2.02 pKa2 = 8.80 pI = 5.41 + – Asparagina H3N C C O H2NCCH2 O

Amminoacidi con catena ionizzabile H O pKa1 = 1.88 pKa2 = 3.65 pKa3 = 9.60 pI = 2.77 + – Acido aspartico H3N C C O OCCH2 O –

H O pKa1 = 2.19 pKa2 = 4.25 pKa3 = 9.67 pI = 3.22 + – Acido glutammico H3N C C O OCCH2CH2 – O H3N C O – H + CH2 OH pKa1 = 2.20 pKa2 = 9.11 pKa3 = 10.07 pI = 5.66 Tirosina

H3N C O – H + CH2 OH pKa1 = 2.20 pKa2 = 9.11 pKa3 = 10.07 pI = 5.66 Tyrosine

H3N C O – CH2SH H + pKa1 = 1.96 pKa2 = 8.18 pKa3 = 10.28 pI = 5.07 Cisteina H3N C O – H + CH2CH2CH2CH2NH3 pKa1 = 2.18 pKa2 = 8.95 pKa3 = 10.53 pI = 9.74 Lisina

H3N C O – H + CH2CH2CH2NHCNH2 NH2 pKa1 = 2.17 pKa2 = 9.04 pKa3 = 12.48 pI = 10.76 Arginina H3N C O – H + CH2 NH N pKa1 = 1.82 pKa2 = 6.00 pKa3 = 9.17 pI = 7.59 Istidina

Curva di titolazione per l’Alanina

Sintesi degli Amminoacidi 4

Dagli acidi a-alogeno carbossilici CH3CHCOH Br O CH3CHCO NH3 O H2O – + 2NH3 + NH4Br + (65-70%)

Sintesi di Strecker CH3CH O NH4Cl CH3CHC NH2 N NaCN 1. H2O, HCl, calore 2. HO– CH3CHCO NH3 O + – (52-60%)

Sintesi acetoammidomalonica CH3CH2OCCCOCH2CH3 H CH3CNH O 1. NaOCH2CH3 2. C6H5CH2Cl O CH3CH2OCCCOCH2CH3 CH2C6H5 CH3CNH (90%) O

O HCCOH (65%) H3N CH2C6H5 + HBr, H2O, calore O CH3CH2OCCCOCH2CH3 CH2C6H5 CH3CNH

Reazioni degli Amminoacidi 4

Acilazione del gruppo amminico Il gruppo amminico con un agente acilante viene trasformato in ammide. O CH3COCCH3 O H3NCH2CO – + + CH3CNHCH2COH O (89-92%)

Esterificazione del gruppo carbossilico H3NCHCO – + CH3 + CH3CH2OH HCl O + – Cl H3NCHCOCH2CH3 (90-95%) CH3

Test alla Ninidrina OH O O H3NCHCO – + R + O N – O RCH + CO2 + H2O +

Risoluzione enzimatica degli amminoacidi

Risoluzione chimica degli amminoacidi

Peptidi 4

Peptidi I peptidi sono composti in cui un legame ammidico (legame peptidico) lega il gruppo amminico di un a-ammino acido con il gruppo carbossilico di un altro.

Alanina e Glicina CH3 O C + H – H3N O C H H3N + – CH3 O C H3N + H N – dipeptide

Alanilglicina CH3 O C H3N + H N – N-terminale C-terminale Ala—Gly AG

Isomeri costituzionali CH3 O C H3N + H N – Alanilglicina Ala—Gly AG H O C H3N + N CH3 – Glicilalanina Gly—Ala GA Isomeri costituzionali

Il legame peptidico ha geometria planare. Alanilglicina CH3 O C H3N + H N – Il legame peptidico ha geometria planare.

Determinazione della struttura di un Peptide 4

Struttura primaria Strategia (Sanger) La struttura primaria è data dalla sequenza di amminoacidi e dai ponti disolfuro Strategia (Sanger) Premio Nobel per la Chimica 1958 e 1980 Sequenza dei peptidi

1. Determinazione degli amminoacidi presenti e loro rapporto molare. 2. Scissione del peptide in frammenti e determinazione della composizione amminoacilica dei frammenti. 3. Identificazione degli amminoacidi N-terminale e C-terminale nel peptide e nei frammenti. 4. Organizzzione delle informazioni fino a defenire la sequenza.

L’idrolisi acida del peptide peptide (6 M HCl, 24 hr) porta alla miscela degli amminoacidi. La miscela può essere smistata nei suoi componenti mediante cromatografia a scambio ionico, che dipende dal pI degli amminoacidi. Gli amminoacidi sono evidenziati mediante ninidrina. Un analizzatore automatico richiede solo10-5 - 10-7 g di peptide. L’idrolisi acida scinde tutti i legami peptidici, per ottenere frammenti bisogna condurre un’idrolisi parziale mediante enzimi.

Carbossipeptidasi La carbossipeptidasi è un enzima proteolitico che catalizza l’idrolisi delle proteine scindendo selettivamente il legame peptidico che coinvolge l’amminoacido C-terminale. proteina H3NCHC O R + NHCHCO – C

Tripsina La tripsina scinde selettivamente il legame peptidico Che impegna il gruppo carbossilico della lisina o dell’arginina. NHCHC O R' R" R lisina o arginina

Chimotripsina La chimotripsina scinde selettivamente i legami Peptidici che impegnano il gruppo carbossilico di amminoacidi aromatici. NHCHC O R' R" R fenilalanina, tirosina, triptofano

Amminoacido N-terminale La sequenza amminoacilica è ambigua fino a che non si definiscono gli amminoacidi N- e C- terminali. L’amminoacido C-terminale può essere determinato mediante idrolisi enzimatica con carbossipeptidasi. E’ possibile determinare l’amminoacido N-terminale sfruttando il maggior carattere nucleofilo dedll’N terminale rispetto agli N ammidici.

Metodo di Sanger Il reagente è l’1-fluoro-2,4-dinitrobenzene. L’1-fluoro-2,4-dinitrobenzene reagisce come nucleofilo nella sostituzione aromatica. F O2N NO2 NHCH2C NHCHCO CH3 NHCHC CH2C6H5 H2NCHC O CH(CH3)2 – + O2N NO2 NHCH2C NHCHCO CH3 NHCHC CH2C6H5 O CH(CH3)2 –

O2N NO2 NHCH2C NHCHCO CH3 NHCHC CH2C6H5 O CH(CH3)2 – O O2N NO2 NHCHCOH H3NCHCO– CH2C6H5 + + H3NCH2CO– O O + + + + H3NCHCO– CH3

Insulina L’insulina è un polipeptide costituito da 51 amminoacidi. Ha due catene: quella A formata da 21 amminoacidi e quella B formata da 30 amminoacidi. FVNQHLCGSHLVGALYLVCGERGFFYTPKA Catena B

La fenilalanina (F) è N terminale. FVNQHLCGSHL SHLV LVGA VGAL ALY YLVC VCGERGF GFFYTPK YTPKA

Struttura Primaria dell’insulina bovina N terminale A 5 15 10 20 25 30 S F V N Q H L C G A Y E R I K P T C terminale A N terminale B C terminale B

Degradazione di Edman 1. Metodo per la determinazione dell’amminoacido N-terminale. 2. Può essere utilizzato in sequenza per determinare i primi 20 amminoacidi a partire dall’N-terminale. 3. Richiede campioni di solo 10-10 g. 4. E’ stato automatizzato. N C S Fenil isotiocianato

peptide H3NCHC O R + NH C6H5N C S + peptide C6H5NHCNHCHC O R NH S

peptide C6H5NHCNHCHC O R NH S HCl (anidro) C6H5NH C S N CH R O peptide H3N + + tiazolone

Il tioazolone isomerizza a feniltioidantoina che viene identificata mentre il residuo peptidico può essere sottoposto ad una seconda degradazione di Edman. C N HN CH R O S C6H5 C6H5NH C S N CH R O peptide H3N + +

Meccanismo della Degradazione di Edman

Struttura Secondaria delle Proteine 4

Struttura Primaria = sequenza di amminoacidi e ponti disolfuro. Struttura secondaria = relazione conformazionale fra amminoacidi spazialmente vicini: a elica e foglietto b pieghettato

La struttura b è molto comune con proteine costituite da amminoacidi con piccole catene laterali (glicina, alanina, serina). La fibroina (principale proteina della seta) è caratterizzata dalla sequenza ripetuta: —Gly—Ser—Gly—Ala—Gly—Ala

Le catene adiacenti sono antiparallele Legami idrogeno fra N—H e O=C delle catene

a Elica a elica di una proteina formata solo da L-alanina. L’elica è destrorsa con 3.6 amminoacidi per giro. I legami idrogeno sono interni alla catena. Proteine dei muscoli (miosina) e della lana(a-cheratina) hanno una struttura a-elica.

Carboxypeptidase tube model ribbon model Disulfide bond Zn2+ Arg-145 N-terminus C-terminus tube model ribbon model

Sintesi dei peptidi 4

Il problema della sintesi dei peptidi è legato al fatto che devono reagire fra loro molecole bifunzionali per cui per ottenere la voluta sequenza non basta mettere insieme i due amminoacidi. Se ad esempio volendo la sequenza Phe—Gly mettessimo insieme fenil alanina e glicina otterremmo i quattro dipeptidi: Phe—Phe Gly—Gly Phe—Gly Gly—Phe Bisogna proteggere il gruppo anmminco dell’amminoacido che dovrà essere quello N-terminale ed il gruppo carbossilico di quello che sarà C-terminale

N-Protetto fenilalanina C-Protetto glicina NHCHCOH CH2C6H5 O X H2NCH2C O Y NHCH2C O Y NHCHC CH2C6H5 X

NHCH2C O Y NHCHC CH2C6H5 X NHCH2CO O H3NCHC CH2C6H5 + – Phe-Gly

Protezione gruppo amminico 4

Benzilossicarbonil cloruro CH2OCCl O H3NCHCO CH2C6H5 O – + + 1. NaOH, H2O 2. H+ NHCHCOH CH2C6H5 O CH2OC (82-87%)

NHCHCOH CH2C6H5 O CH2OC ZNHCHCOH CH2C6H5 O abbreviato: o Z-Phe Rimozione: a) idrogenolisi b) scissione con HBr in acido acetico

NHCHCNHCH2CO2CH2CH3 CH2C6H5 O CH2OC H2, Pd H2NCHCNHCH2CO2CH2CH3 CH2C6H5 O CH3 CO2 (100%)

NHCHCNHCH2CO2CH2CH3 CH2C6H5 O CH2OC HBr H3NCHCNHCH2CO2CH2CH3 CH2C6H5 O CH2Br + CO2 Br – (82%)

tert-Butossicarbonilazide NHCHCOH CH2C6H5 O (CH3)3COC abbreviato: BocNHCHCOH CH2C6H5 O o Boc-Phe

O O (CH3)3COC NHCHCNHCH2CO2CH2CH3 CH2C6H5 HBr H3NCHCNHCH2CO2CH2CH3 CH2C6H5 O CH2 C H3C + CO2 Br – (86%)

Protezione del gruppo Carbossilico 4

Deprotezione degli esteri avviene per idrolisi basica. Gli esteri benzilici possono essere subire idrogenolisi. Il gruppo carbossilico viene protetto come estere.

NHCHCNHCH2COCH2C6H5 CH2C6H5 O C6H5CH2OC H2, Pd H3NCHCNHCH2CO CH2C6H5 O + – C6H5CH3 CO2 CH3C6H5 (87%)

Formazione del legame peptidico 4

DCC O O ZNHCHCOH H2NCH2COCH2CH3 + CH2C6H5 DCC, cloroformio O ZNHCHC NHCH2COCH2CH3 (83%)

ZNHCHCOH CH2C6H5 O + C6H11N C NC6H11 CH2C6H5 O C6H11N C H OCCHNHZ

C6H11N C C6H11NH H O ZNHCHC CH2C6H5 O NHCH2COCH2CH3 + H2NCH2COCH2CH3 O H2NCH2COCH2CH3 O H2NCH2COCH2CH3 O CH2C6H5 O C6H11N C H OCCHNHZ

Estere attivo ZNHCHCO CH2C6H5 O H2NCH2COCH2CH3 O NO2 + cloroformio (78%)

Sintesi in fase solida: Merrifield Premio Nobel in Chimica: 1984 4

Supporto CH2 CH Copolimero stirene divinilbenzene

Supporto CH2 CH Trattando il polimero con ClCH2OCH3 e SnCl4 si funzionalizzano alcuni anelli benzenici con ClCH2. CH2 CH CH2Cl

CH2 CH CH2Cl BocNHCHCO R O – CH2 CH BocNHCHCO R O

CH2 CH NHCHCO R O NHCHC R' C + H3N peptide

CH2 CH CH2Br NHCHCO R O NHCHC R' C + H3N peptide –