Corso di Biochimica clinica Valutazione di laboratorio delle Cardiopatie congenite Prof. Giuseppe Castaldo (anno accademico 2015-16)

Classificazione delle Cardiomiopatie (CMP) Società Europea di Cardiologia (2008) CMP ipertrofica CMP dilalativa CMP restrittiva CMP aritmogena del ventricolo destro CMP non classificate Familiari/genetiche Non familiari/non genetiche Non c’è distinzione tra forme primarie e secondarie

Modalità di trasmissione

TRASMISSIONE AUTOSOMICA DOMINANTE

TRASMISSIONE AUTOSOMICA DOMINANTE

PENETRANZA VARIABILE Storia naturale delle cardiomiopatie ereditarie: Senza sintomi e segni (normale esame cardiologico, normale ECG/ECO) Senza sintomi ma con alterazioni variabili all’ ECG/ECO Con sintomi, espressione tipica della malattia Il rischio di morte improvvisa (SCD) vi è sempre

VARIABILE ESPRESSIVITA’ Severità variabile nell’espressione fenotipica, con notevoli differenze in relazione a: età di insorgenza gravità dei sintomi severità delle alterazioni ECG/ECO rischio di complicanze risposta ai trattamenti medici

VARIABILITA’ CLINICA ETEROGENEITA’ GENETICA geni multipli multiple mutazioni nello stesso gene o in più geni differenti meccanismi patogenetici FATTORI AMBIENTALI

UTILITA’ DELLA DIAGNOSI MOLECOLARE 28-Apr-17 UTILITA’ DELLA DIAGNOSI MOLECOLARE Conferma diagnostica, diagnosi definitiva Diagnosi differenziale Identificazione dei portatori nella famiglia Possibilità di diagnosi prenatale nella famiglia Contributo alla definizione del rapporto genotipo-fenotipo

Cardiomiopatia Ipertrofica (HCM) Prevalenza: 1:500 Sporadica (40%) Familiare (60%) Autosomica dominante Penetranza incompleta

Cardiomiopatia Ipertrofica (HCM) Spesso asintomatica L’ispessimento del setto o di altre strutture può causare diverse anomalie: Ridotto riempimento diastolico Ridotto afflusso di sangue al tessuto cardiaco (ischemia) Anomalie del ritmo In genere benigna

Cause di ipertrofia cardiaca Ipertensione Cuore d’atleta Obesità Feocromocitoma Terapie steroidee Diabete gestazionale Dopo aver escluso: Errori congeniti del metabolismo Sindromi malformative Disordini neuromuscolari HCM Familiare

Spettro delle manifestazioni cliniche nei pazienti HCM

Cardiomiopatia ipertrofica (HCM) Caratteristiche genetiche GENI HCM Geni codificanti proteine sarcomeriche (60%): MYH7, MYBPC3, TNNT2, TNNI3, TPM1, MYL2, MYL3, ACTC1 Geni codificanti proteine del disco Z (<5%): T-CAP, MYOZ2, ACTN2, CSRP3, LBD3, VCL, ANKRD1, TTN

GENI CHE CODIFICANO PER PROTEINE SARCOMERICHE (40-60%): MYH7, MYBPC3, TNNT2, TNNI3, TPM1, MYL2, MYL3, ACTC GENI CODIFICANTI PROTEINE DEL DISCO Z (<5%): TTN, T-CAP, MYOZ2, ACTN2, CSRP3, LBD3, VCL GENI CODIFICANTI PROTEINE LEGANTI CALCIO (rari): PLN, JPH2 GENE CODIFICANTE OBSCURINA (raro): OBSN MUTAZIONI IN GENI ASSOCIATI A DISTURBI METABOLICI E DISORDINI NEUROMUSCOLARI ( Fenocopie, 3%): PRKAG2, LAMP2, GLA, FTX, RAF1, PTPN11

PAZIENTI HCM MUTATI vs PAZIENTI HCM NON MUTATI Maggiore prevalenza di storia familiare di HCM e SCD Ipertrofia più severa Maggiore disfunzione microvascolare Maggiore fibrosi miocardica

HCM e SUDDEN CARDIAC DEATH (SCD) SCD nella populazione generale 1/1,000/anno (≥ 35 anni di età)

FATTORI DI RISCHIO PER MORTE IMPROVVISA Anche la presenza di mutazioni maligne della -miosina o mutazioni della Troponina T o doppie o triple mutazioni sono fattore di rischio per la morte improvvisa

GENETIC EVALUATION OF CARDIOMYOPATHY GUIDELINES GENETIC EVALUATION OF CARDIOMYOPATHY EUROPEAN SOCIETY OF CARDIOLOGY WORKING GROUP ON MYOCARDIAL AND PERICARDIAL DISEASES Charron et al. Eur Heart J 2010 Elliott et al. Eur Heart J 2014

Diagnosi molecolare Estrazione di DNA da sangue periferico Amplificazione della regione codificante e del 5’ e 3’ UTR mediante PCR (Polymerase Chain Reaction) GENE N° AMPLICONI MYH7 42 MYBPC3 34 TNNI3 9 TPM1 10 TNNT2 17 ACTC 8 MYL2 7 MYL3 Screening degli 134 amplificati per la ricerca di sostuituzioni nucleotidiche mediante sequenziamento

CASO CLINICO 2 M.G. : giunta all’attenzione dei cardiologi all’età di 2 anni SINTOMI: Dispnea e palpitazioni SEGNI: Soffio di lieve entità in corrispondenza del focolaio di auscultazione della mitrale

DIAGNOSI: CARDIOMIOPATIA IPERTROFICA Anomalie aspecifiche della ripolarizzazione rare extrasistoli ventricolari Elettrocardiogramma : S.I.V. 17 mm (v.n. 10 mm) Z-score: 6,4 (v.n. <2) Ecocardiogramma bi-dimensionale: DIAGNOSI: CARDIOMIOPATIA IPERTROFICA

HCM: epidemiologia molecolare Gene Protein Mutation Frequency MYH7 -myosin heavy chain 30%-40% MYBPC3 Myosin-binding protein C TNNT2 Cardiac troponin T 10%-20% TPM1 -tropomyosin 2%-5% TNNI3 Cardiac troponin I MYL2 Myosin regulatory light chain 1-3% MYL3 Myosin essential light chain ACTC1 Cardiac actin TTN Titin Rare MYH6 -myosin heavy chain TCAP Titin-cap or telethonin TNNC1 Troponin C Modificata da Hershberger et al. J Card Failure 2009

HCM16 PEDIGREE A A G G N A G MYBPC3 Esone 32: c.3627+2 T>A II III I.1 I.2 II.1 II.2 III.1 M.G. c.3627+2A / WT I.3 I.4 MYBPC3 Esone 32: c.3627+2 T>A Splice-site mutation A A G G N A G MYBPC3 cDNA WT:Wild Type 27

MYBPC3 c.3627+2 T>A Splice-site mutation p.K1163fs32X p.K1163fs64X * * * *:c.3627+2T>A Frisso et al. Clin Genet 2009

HCM16 PEDIGREE I II III I.1 na I.2 na I.3 na I.4 na II.1 WT/c.3627+2A WT/WT III III.1 M.G. c.3627+2A / WT MYBPC3 cDNA WT:Wild Type na: not analysed 29

HCM16 PEDIGREE I II III I.1 WT/WT I.2 WT/c.3627+2A I.3 na I.4 na II.1 III.1 M.G. c.3627+2A / WT MYBPC3 cDNA WT:Wild Type na: not analysed 30

ANAMNESI PERSONALE E FAMILIARE Severa ipertrofia ventricolare alla nascita Il padre (38 y.o.) è asintomatico, la nonna paterna (62 y.o.) mostra una lieve ipertrofia (MTW: 13 mm) che, associata all’ipertensione, era stata considerata secondaria ETEROGENEITA’ INTRAFAMILIARE DEL FENOTIPO

IL TEST GENETICO E’ APPROPRIATO PER ESEGUIRE DIAGNOSI NEI FAMILIARI ASINTOMATICI, QUANDO E’ STATA PRECEDENTEMENTE IDENTIFICATA LA MUTAZIONE NEL PROBANDO 32

Sindromi aritmogeniche ereditarie Gruppo di patologie cardiache, caratterizzate da alterata funzionalità del miocardiocita, che predispone alla comparsa di aritmie cardiache maligne, in assenza di alterazioni morfologiche evidenti Possono precipitare in arresto cardiaco e morte improvvisa, generalmente in individui giovani, bambini o adolescenti, apparentemente in buona salute Sebbene siano malattie con una mortalità molto alta tra i pazienti non trattati, quando correttamente diagnosticate possono beneficiare di terapie molto efficienti (beta-bloccanti e l'impianto di defibrillatori) Malattie a penetranza incompleta ed espressività variabile

Sindromi aritmogeniche ereditarie Costituiscono uno spettro di patologie note come “canalopatie” Eterogeneità fenotipica e all’ECG

Sindromi aritmogeniche ereditarie: fenotipi Sindrome del QT lungo (LQTS1-12) Sindrome di Brugada (BrS1-4) Tachicardia ventricolare polimorfica catecolaminergica (CPVT1-2) Sindrome del QT corto (SQTS1-3)

Sindromi aritmogeniche ereditarie: basi genetiche SINDROME GENE PROTEINA LQT1 e SQT1 KCNQ1 IKs catena  LQT2 e SQT2 KCNH2 IKr catena  LQT3 e BrS1 SCN5A INa catena  LQT4 ANK2 anchirina LQT5 KCNE1 IKs catena  LQT6 KCNE2 IKr catena  LQT7 e SQT3 KCNJ2 IK1 LQT8 e BrS4 CACNA1C ICa canale L LQT9 CAV3 caveolina LQT10 SCN4B INa catena  LQT11 AKAP9 Yotiao LQT12 SNTA1 syntrophin  1 CPVT1 hRyR2 recettore della rianodina CPVT1 CASQ2 calsequestrina

Sindromi aritmogeniche ereditarie: basi genetiche Canali del potassio Canale del sodio Canale del calcio

Il potenziale d’azione cardiaco Entrata di calcio Uscita di potassio Entrata di sodio Lo scambio di ioni attraverso la membrana del miocardiocita determina il potenziale d’azione. La presenza di un difetto dei canali ionici cardiaci altera tali scambi mediante un aumento o una riduzione delle correnti ioniche (gain or loss of function)

GENESI DEL POTENZIALE D’AZIONE CARDIACO Fase 0, depolarizzazione rapida (ingresso di Na+) Fase 1, ripolarizzazione precoce (corrente transitoria, uscita di K+) Fase 2, plateau (ingresso di Ca2+ eguaglia la fuoriuscita di K+ ) Fase 3, ripolarizzazione tardiva (K+ dipendente) Caratterizzato da lunga durata, con allungamento del periodo refrattario assoluto Fase 4, Potenziale di riposo stabile (- 80 mV)

Sindrome del QT lungo (LQTS) Sindrome aritmogena, ereditaria o acquisita, caratterizzata dall’allungamento del QTc e da anomalie della ripolarizzazione Prevalenza: 1/5.000 Causa di 3.000/4.000 morti improvvise tra bambini ed adulti ogni anno negli Stati Uniti Mutazioni di tipo “gain of function” nel gene del canale del sodio (SCN5A), o di tipo “loss of function” nei geni dei canali cardiaci del potassio

LQTS Gain of function del canale del sodio Loss of function dei canali del potassio

LA SINDROME DEL QT LUNGO L’allungamento della fase di depolarizzazione o il ritardo di ripolarizzazione si traduce in termini elettrocardiografici come un prolungamento del tratto Q-T Intervallo Q-T: Durata del ciclo depolarizzazione-ripolarizzazione dei cardiomiociti ventricolari Nella norma è < 440 msec nell’uomo, 460 nella donna Sintomi principali: attacchi sincopali aritmie morte improvvisa

LQTS: basi genetiche Pochi casi descritti SINDROME GENE PROTEINA LQT1 KCNQ1 IKs catena  LQT2 KCNH2 IKr catena  LQT3 SCN5A INa catena  LQT4 ANK2 anchirina LQT5 KCNE1 IKs catena  LQT6 KCNE2 IKr catena  LQT7 KCNJ2 IK1 LQT8 CACNA1C ICa canale L LQT9 CAV3 caveolina LQT10 SCN4B INa catena  LQT11 AKAP9 Yotiao LQT12 SNTA1 syntrophin  1 70% dei pz LQTS Pochi casi descritti

LQTS: basi genetiche SINDROME GENE PROTEINA LQT1 KCNQ1 IKs catena  LQT2 KCNH2 IKr catena  LQT3 SCN5A INa catena  LQT4 ANK2 anchirina LQT5 KCNE1 IKs catena  LQT6 KCNE2 IKr catena  LQT7 KCNJ2 IK1 LQT8 CACNA1C ICa canale L LQT9 CAV3 caveolina LQT10 SCN4B INa catena  LQT11 AKAP9 Yotiao LQT12 SNTA1 syntrophin  1 Forme sindromiche

CASO CLINICO N°1 P.M. F, 8 anni SINTOMI: episodio sincopale, a riposo, che richiede il ricorso al pronto soccorso Si esegue un controllo biochimico in urgenza ed un ECG

CASO CLINICO N°1 ECG : Blocco di branca sinistro QT = 530 msec (460) ANAMNESI REMOTA: alcuni episodi di lipotimia di ndd ANAMNESI PROSSIMA: negativa. La madre nega assunzione di farmaci ANAMNESI FAMILIARE: Descritti in famiglia casi di morte improvvisa per cause non note DIAGNOSI CLINICA: Sospetta Sindrome del QT lungo TERAPIA: Propanololo

dei cardiomiociti ventricolari Confronto ECG V1 Intervallo Q-T: Durata del ciclo depolarizzazione- ripolarizzazione dei cardiomiociti ventricolari Nella norma è < 460 msec V2 V3 V1 V1 Intervallo QT allungato V2 V2 V3 V3 QT corretto: formula di Bazett QTc=490 msec

PEDIGREE QT 4 I II III IV I:1 I:2 II:1 II:2 II:3 II:4 III:1 III:2

dopo ECG a tutti i membri della famiglia PEDIGREE QT 4, dopo ECG a tutti i membri della famiglia I II III IV I:1 I:2 II:1 II:2 III:1 III:2 III:3 III:4 IV:1 IV:2 II:3 II:4 III:5 III:6 SI RICHIEDE IL TEST GENETICO PER LA CONFERMA DIAGNOSTICA

La Sindrome del QT lungo ereditaria GENE CROMOSOMA LQT1 KCNQ1 11 LQT2 KCNH2 7 LQT3 SCN5A 3 LQT4 ANK2 4 LQT5 KCNE1 21 LQT6 KCNE2 LQT7 KCNJ2 2 LQT8 CACNA1C 12 LQT9 CAV3 LQT10 SCN4B LQT11 AKAP9 LQT12 SNTA1 20 70-75% DEI PAZIENTI 50

PROCEDURA DI SCREENING Estrazione di DNA e RNA da leucociti di sangue periferico dei pazienti

PROCEDURA DI SCREENING Estrazione di DNA da sangue periferico dei pazienti Amplificazione di ogni esone mediante PCR (86 ampliconi) SM 4/12 4/13 4/16 B 4/12 4/13 4/16 B 4/12 4/13 4/16 B 4/12 4/13 4/16 B 4/12 4/13 4/16 B

Sequenziamento bidirezionale: SCN5A, esone 28C ACC GAG CCC T E P ACC AAG CCC T K P p.Glu1784Lys WT N Mut c.5350G>A

Proteina SCN5A protein p.E1784K Extracellular Intracellular DI DIV DIII DII COO- S1 p.E1784K S6 SCN5A protein

CONSEGNA DEL REFERTO Consulenza multidisciplinare Scopo: Chiarire le relazioni genotipo-fenotipo Allargare lo screening per individuare eventuali soggetti a rischio.

La mutazione segrega con la malattia SCN5A I:1 I:2 II II:1 II:2 II:3 II:4 WT c.5350G>A III III:1 III:2 III:3 III:4 III:5 III:6 WT c.5350G>A WT c.5350G>A IV IV:1 IV:2 WT c.5350G>A

Il test genetico ha individuato un portatore silente SCN5A I:1 I:2 II II:1 II:2 II:3 II:4 WT c.5350G>A III III:1 III:2 III:3 III:4 III:5 III:6 WT c.5350G>A WT c.5350G>A WT c.5350G>A IV IV:1 IV:2 WT c.5350G>A

Il test genetico permette la diagnosi precoce alla nascita SCN5A I:1 I:2 II II:1 II:2 II:3 II:4 WT c.5350G>A III III:1 III:2 III:3 III:4 III:5 III:6 WT c.5350G>A WT c.5350G>A WT c.5350G>A IV IV:1 IV:2 WT c.5350G>A WT c.5350G>A

HIGH THROUGHPUT SEQUENCING Sequenza di 202 genes, comprendenti geni: HCM related Ionic channels Inflammation and cardiac fibrosis Transcriptional Factors Histone (de)acetylases Growth factors MAP Kinases ROS production Obiettivo: Identificatione di nuovi geni HCM related Identificatione di geni modificatori

GENI LQTS Tester et al. Annu. Rev. Med. 2009

La diagnosi genetica può rivelare caratteristiche precedentemente undetected High throughput sequencing permette simultaneamente la rapida e accurata analisi di centinaia di differenti geni ad un costo comparabile a quello corrente per l’analisi di qualche dozzina di geni

Tuttavia ….