UNIVERSITA’ DEGLI STUDI DI TORINO Facoltà di Farmacia PREPARAZIONE DI NANOPARTICELLE LIPIDICHE SOLIDE DA EMULSIONI CONTENENTI SOLVENTI PARZIALMENTE SOLUBILI IN ACQUA Relatore: Prof. Michele Trotta Candidato: Roberta Zappino

Solid Lipid Nanoparticles SLN® Solid Lipid Nanoparticles Bassa tossicità Possibilità di inglobare e aumentare la stabilità di molti farmaci Aumento della biodisponibilità e ottenimento di un rilascio prolungato dei farmaci inglobati

Uso di sistemi emulsionati Diluizione a partire da microemulsioni Omogeneizzazione a temperatura superiore a quella di fusione del lipide Produzione di SLN Uso di sistemi emulsionati Diluizione a partire da microemulsioni

SCOPO DELLA TESI Preparazione di SLN attraverso la tecnica del quenching (diluizione) Uso di solventi parzialmente solubili in acqua Temperatura inferiore a quella di fusione del lipide Applicazione della tecnica di omogeneizzazione ad alta pressione per ottenere SLN di dimensioni inferiori

GLICERIL MONOSTEARATO (GMS) CAS number : 031566-31-1 Formula bruta : C21H42O4 P.M.: 358,57 Punto di fusione: 57°C Log P (ottanolo-acqua): 6,62 57°C

SOLUBILITA’ IN ACQUA A 20°C SOLVENTI UTILIZZATI Alcol benzilico Butil lattato Dietil succinato SOLUBILITA’ IN ACQUA A 20°C Alcol benzilico (A) 38 g/l Butil lattato (B) 77 g/l Dietil succinato (C) 19 g/l

SOLUBILITA’ DEL GMS NEI SOLVENTI UTILIZZATI (mg/ml) Alcol benzilico Butil lattato Dietil succinato 40°C 46,5±1,8 54±2 28,6±0,9 50°C 1820±10 1250±15 732±9 55°C 2720±20 2030±22 1680±16 Alcol benzilico 46,5±1,8 1820±10 2720±20 Dietil succinato 28,6±0,9 732±9 1680±16

COPPIE DI EMULSIONANTI FORMULAZIONI EMULSIONE COPPIE DI EMULSIONANTI A1, B1, C1 Tween 80/Oramix CG110 A2, B2, C2 Tween 80/Epikuron 200 A3,B3,C3 Oramix CG110/Epikuron 200 A4,B4,C4 Epikuron 200/TDC

COPPIA DI EMULSIONANTI Epikuron 200/Sodio colato FORMULAZIONI EMULSIONE COPPIA DI EMULSIONANTI A5 Epikuron 200/Sodio colato

EMULSIONE 4 2,5% 16% 2,5% (I) 5% (II) 8% (III) 10% (IV) 12% (V) 14% EMULSIONI A4,B4, C4 GMS (%) 2,5% (I) 5% (II) 8% (III) 10% (IV) 12% (V) 14% (VI) 16% 2,5% 16% Epikuron 200 TDC

Solvente + GMS Acqua + tensioattivi Riscaldamento T = 50°C 1° STEP EMULSIONE GROSSOLANA NANOEMULSIONE Ultra Turrax 24000 rpm, 15’’ 2° STEP Acqua + tensioattivi

Diluizione 1:10 Quenching Ultrafiltrazione NANOEMULSIONE 3° STEP Diluizione 1:10 Quenching 3° STEP NANOSOSPENSIONE 4° STEP SOLVENTE TENSIOATTIVI Ultrafiltrazione

Microfotografia di una nanosospensione ottenuta da un’emulsione contenente il 5% di lipide. (63x12,5 ingrandimenti) Microfotografia di una nanosospensione ottenuta da un’emulsione contenente il 12% di lipide. (63x12,5 ingrandimenti)

Microfotografie ottenute con TEM della nanosospensione A4 (IV) GMS al 12% Diametro medio: 850 nm (ingrandimento originale 21000X) Diametri: 650 nm e 990 nm (ingrandimento originale 40000X)

205 B4 C4 A4 DIAMETRO MEDIO (nm) (P.I.) POTENZIALE Z (mV) Emulsione 4 GMS (%) SOSPENSIONE A4 (Alcol benzilico) SOSPENSIONE B4 (Butil lattato) SOSPENSIONE C4 (Dietil succinato) A4 B4 C4 2,5% 205±15 (0,08) 321±13 (0,09) 301±12 (0,10) -35,57 -21,88 -18,81 (I) 5% 291±22 (0,14) 330±15 440±21 (0,13) -29,97 -17,67 (II) 8% 508±21 342±14 (0,12) 640±14 (0,16) -30,90 -19,48 -20,04 (III) 10% 712±19 (0,11) 413±20 (0,15) 834±13 (0,06) -37,55 -19,17 -21,68 (IV) 12% 898±31 (0,21) 450±16 (0,20) 850±27 -36,38 -19,79 -16,61 (V) 14% 1020±45 (0,17) 530±14 (0,25) 873±29 (0,19) -31,95 -19,07 -17,14 (VI) 16% 1200±48 706±21 (0,22) 935±36 (0,23) -31,49 -20,54 -20,00 205 -35,57 -29,97 -30,90 -37,55 -36,38 -31,95 -31,49

DETERMINAZIONE DEI RESIDUI DI SOLVENTE E TENSIOATTIVI EMULSIONE A4 Alcol benzilico (saturo) 10% GMS 2,5% TDC 0,5% Epikuron 200 0,5% Acqua (satura) 86,5% CENTRIFUGAZIONE ULTRAFILTRAZIONE Alcol benzilico ULTRAFILTRAZIONE/ LIOFILIZZAZIONE TDC Epikuron 200 Alcol benzilico Epikuron 200 TDC Centrifugato 31 ppm 4 ppm 17 ppm Dializzato 30 ppm 3 ppm 16 ppm Liofilizzato 28 ppm 15 ppm

Calorimetria Differenziale a Scansione DSC Calorimetria Differenziale a Scansione Termogramma relativo ad una sospensione di SLN a confronto con termogramma relativo al GMS prodotto commerciale (riscaldamento da 25°C a 80°C a 5°C al minuto)

DEGRADAZIONE Nanosospensione di SLN ottenute dall’emulsione C4(IV) Sospensione acquosa di GMS 37°C pH 7,4 TRE SETTIMANE 60°C pH 10,5 CINQUE ORE PRELIEVO HPLC

ACIDO STEARICO LIBERATO Test di degradazione a 37°C Test di degradazione a 60°C

INFLUENZA DEI TENSIOATTIVI SULLA DEGRADAZIONE DELLE SLN

OMOGENEIZZAZIONE AD ALTA PRESSIONE EMULSIONE A4 Microfotografia realizzata con TEM della nanosospensione A4 ottenuta dall’emulsione A4 omogeneizzata ad alta pressione Diametro medio: 101 nm (ingrandimento originale 73000X) 1 ciclo a 500 bar 2 cicli a 250 bar 2 cicli a 500 bar TRATTAMENTO Emulsione A4 DIAMETRO MEDIO (nm) (P.I.) Ultra Turrax® 205,0 (0,08) 1 ciclo a 500 bar 109,0 (0,221) 2 cicli a 250 bar 113,2 (0,202) 2 cicli a 500 bar 98,9 (0,206) 205,0 109,0 113,2 98,9

CONCLUSIONI La tecnica del quenching per la preparazione di nanoparticelle lipidiche solide si è dimostrata una valida alternativa alle tecniche riportate in letteratura e ampiamente utilizzate L’aumento del lipide nell’emulsione iniziale è direttamente proporzionale all’aumento dei diametri delle SLN ottenute La presenza di residui minimi di solvente e tensioattivi nelle SLN dopo i trattamenti di lavaggio permette di affermare che le nanoparticelle preparate sono sistemi a bassa tossicità La tecnica di omogeneizzazione ad alta pressione permette di ottenere SLN con diametri dimezzati rispetto alla sola omogeneizzazione rotazionale