SDS = Sodio Dodecil Solfato PAGE = PoliAcrilammide Gel Elettroforesi SDS-PAGE SDS = Sodio Dodecil Solfato PAGE = PoliAcrilammide Gel Elettroforesi Metodo ANALITICO per separare le proteine in base alla loro grandezza e determinare il GRADO DI PUREZZA delle proteine

ELETTROFORESI migrazione di particelle cariche sotto l’influenza di un campo elettrico Molte molecole di interesse biologico possiedono gruppi ionizzabili che, ad un certo valore di pH, sono presenti in soluzione come specie elettricamente cariche Sotto l’influenza di un campo elettrico queste molecole cariche migrano verso il catodo o l’anodo, a seconda che possiedano una carica positiva (cationi) o negativa (anioni)

- Elettroforesi + catodo anodo + + - + catodo anodo Velocità di Migrazione Direttamente proporzionale alla CARICA NETTA Inversamente proporzionale alla GRANDEZZA

Elettroforesi - + + + - + Velocità di Migrazione + + - + Velocità di Migrazione Direttamente proporzionale al rapporto CARICA / MASSA

Elettroforesi su GEL: quando il campo elettrico viene annullato le proteine restano nel punto che avevano raggiunto

Elettroforesi su GEL: quando il campo elettrico viene annullato le proteine restano nel punto che avevano raggiunto + -

Elettroforesi su GEL: quando il campo elettrico viene annullato le proteine restano nel punto che avevano raggiunto + - Il tampone deve mantenere costante lo stato di ionizzazione delle molecole che devono essere separate

Elettroforesi su GEL: quando il campo elettrico viene annullato le proteine restano nel punto che avevano raggiunto Aggiunta del Fissativo

APPARECCHIATURA PER ELETTROFORESI COMPONENTI PRINCIPALI Alimentatore Cella elettroforetica 1. Per elettroforesi su gel verticale 2. Per elettroforesi su gel orizzontale

ELETTROFORESI DI PROTEINE Le proteine hanno una carica netta a qualunque valore di pH diverso dal loro punto isoelettrico (pI) sottoposte ad un campo elettrico le proteine migreranno verso l’elettrodo di carica opposta Quasi tutte le proteine hanno un pI compreso nell’intervallo 3-10 e la maggioranza di esse ha un pI<8 Ne consegue che ad pH= 8 la maggioranza delle proteine ha una carica netta negativa e migrerà verso l’anodo (elettrodo positivo)

ACRILAMMIDE mezzo di supporto utilizzato per l’elettroforesi di proteine e acidi nucleici L’acrilammide polimerizzata si presenta sotto forma di gel La porosità del gel di poliacrilammide può essere regolata variando la percentuale di acrilammide e/o il grado di legami trasversali tra le catene di acrilammide

NORME DI SICUREZZA L’acrilammide è una potente neurotossina come polvere e in forma liquida Indossare una maschera quando si pesa o utilizza la polvere Indossare guanti in tutte le operazioni che prevedono l’utilizzo di acrilammide Le soluzioni non utilizzate devono essere polimerizzate prima di essere eliminate Ogni liquido versato deve essere assorbito immediatamente con tovaglioli di carta ed i tovaglioli eliminati in un recipiente apposito per rifiuti tossici Una volta polimerizzata l’acrilammide perde tossicità

POLIMERIZZAZIONE Acrilammide Bis-acrilammide Copolimerizzazione dei monomeri di acrilammide in presenza di piccole quantità di N,N’-metilene bisacrilammide (bis-acrilammide) La bis-acrilammide, composta da due molecole di acrilammide legate da un gruppo metilene, è utilizzata come agente in grado di formare legami crociati I monomeri di acrilammide polimerizzano nel senso testa-coda e occasionalmente si legano ad una molecola di bis-acrilammide In tal modo nella catena è introdotto un secondo sito per l’estensione formazione di una matrice con legami crociati a struttura ben definita

(molto idrofilico => Trattiene grosse quantità di acqua) Catalisi radicalica Acrilammide metilenbisacrilammide (estere disolfato di H2O2, iniziatore) + TEMED (catalizzatore) GEL di POLIACRILAMMIDE (molto idrofilico => Trattiene grosse quantità di acqua)

SDS-PAGE La tecnica elettroforetica maggiormente adoperata per le molecole proteiche è l’elettroforesi su gel di poliacrilammide in sodio dodecil solfato (SDS-PAGE) L’SDS-PAGE consente la separazione di molecole con un rapporto carica/massa identico, ma di dimensioni molecolari diverse Nell’SDS-PAGE la matrice del gel è una sostanza reticolata che agisce come un setaccio, in cui le forze di attrito fanno diminuire la mobilità elettroforetica delle molecole in relazione alle loro dimensioni

Sodio Dodecil Solfato CH3(CH2)10CH2OSO3- Na+ proteina

(il rapporto CARICA/MASSA è uguale per tutte le proteine) Nella SDS-PAGE la velocità di migrazione è inversamente proporzionale alle dimensioni della proteina (il rapporto CARICA/MASSA è uguale per tutte le proteine) - +

GEL IN GRADIENTE Gel di poliacrilammide nel quale la percentuale di acrilammide varia in modo uniforme dal 5% (alla sommità del gel) al 25% (sul fondo dello stesso) Il gradiente è formato con un formatore di gradiente E’ possibile separare proteine con un intervallo di massa molecolare relativa molto più ampio rispetto ad un gel a porosità costante Proteine con masse molecolari relative simili possono essere separate

messo a colorare , in agitazione, in una soluzione colorante TECNICHE DI RIVELAZIONE Dopo aver tolto la corrente, il gel è rimosso dalle due lastre di vetro e messo a colorare , in agitazione, in una soluzione colorante COOMASSIE BRILLIANT BLUE R-250 Le bande proteiche sono fissate e il gel è immerso in una soluzione che contiene acido acetico e Coomassie Brilliant Blue R-250 sciolto in metanolo Per ottenere bande proteiche omogenee si colora il gel fino a quando non è uniformemente blu (~ 30’ r.t.) successivamente si rimuove il colorante in eccesso immergendo il gel in una soluzione di acido acetico e etanolo

Colorazione delle proteine con nitrato d’argento Il gel è immerso in una soluzione diluita di metanolo/acido acetico per fissare le proteine al gel Il gel è incubato con una soluzione acida di nitrato di argento che reagisce con le proteine L’immagine si forma per riduzione dello ione argento alla sua forma metallica per opera della formaldeide a pH alcalino (sodio carbonato) Lo sviluppo è fermato acidificando la soluzione con acido acetico Il metodo è da 10 a 100 volte più sensibile della colorazione con Coomassie

SDS-PAGE fissato con acido acetico e colorato con BLU COOMASSIE

Applicazioni dell’SDS-PAGE Analisi quantitativa delle proteine presenti nella frazione di interesse Identificazione del P.M. di proteine sconosciute Analisi qualitativa delle proteine presenti nella frazione di interesse (colorazione con Blu Coomassie o western blotting)

10 μg di proteine totali del campione da: Proteina di interesse

Analisi qualitativa di un SDS-PAGE STD Omogenato 5 µl I purif. 10 µl II purif. 15 µl III purif. 20 µl

Western blot Dopo la corsa elettroforetica le proteine possono essere trasferite su un supporto più stabile e “colorate” usando anticorpi specifici Il western blot è circa 100-200 volte più sensibile della colorazione per Blu Coomassie Il gel viene sottoposto ad una carica elettrica “trasversale” che forza le proteine a migrare fuori dal gel, fino ad arrivare sulla membrana a cui aderiscono (nitrocellulosa)

Il filtro viene saturato con BSA o “fat free milk” poiché sulla membrana rimangono dei siti liberi La membrana viene immersa in una soluzione che contiene l’Ab specifico per la proteina di interesse Un secondo Ab, che riconosce la fonte biologica del I, lega un enzima che catalizza una reazione cromogena La reazione con il S dà luogo ad un P luminescente che può essere rivelato per autoradiografia (5)

fosfatasi alcalina converte il 5-bromo-4-cloro-indolofosfato (BCIP), incolore, in un prodotto di colore blu perossidasi di rafano utilizza acqua ossigenata come substrato e ossida il 3-ammino-9-etilcarbazolo in un prodotto insolubile marrone o il 4-cloro-1-naftolo in un prodotto insolubile blu Enhanced chemiluminescence: in presenza di acqua ossigenata e di luminolo, un substrato chemiluminescente, la perossidasi ossida il luminolo con concomitante produzione di luce, la cui intensità aumenta di 1.000 volte in presenza di un intensificatore chimico. La luce emessa può essere rilevata esponendo il blot ad una lastra fotografica

Identificazione del PM di una proteina sconosciuta LogPM (Da) mobilità relativa (mm)

Analisi qualitativa e quantitativa di un SDS-PAGE STD Omogenato 5 µl I purif. 10 µl II purif. 15 µl III purif. 20 µl 0,5µg 2,5 µg Alternativa: densitometria a scansione