Elettroforesi Un processo mediante il quale molecole cariche si separano in un campo elettrico a causa della loro diversa mobilità m = K c/ M = mobilità elettroforetica della molecola K =costante di proporzionalità che dipende dalla ddp applicata e dal mezzo in cui viene fatta l’elettroforesi M = PM della molecola

Elettroforesi di aa Gli aa si frazioneranno durante l’elettroforesi, se l’elettroforesi viene effettuata ad un valore di pH al quale gli aa presenti nella miscela , avranno differenti valori di carica netta Se l’elettroforesi viene fatta ad un pH che corrisponde al PI dell’aa esso non migra

Elettroforesi di proteine PI è compreso tra 3-10, la maggioranza ha pI <8 Quindi a PH = 8 o a pH > 8 la maggior parte delle proteine hanno carica netta – e migreranno all’anodo ( elettrodo positivo)

Supporto per l’elettroforesi Gel di poliacrilammide : copolimerizzazione di un monomero (acrilammide) solubile in acqua e di un agente reticolante Bisacrilammide ( CH2=CH-CO-NH2) acrilammide

Preparazione del gel di poliacrilammide I monomeri di acrilammide polimerizzano nel senso testa-coda, x cui si forma un polimero lineare. Occasionalmente i monomeri di acrilammide si legano alla bis acrilammide e si firmano legami crociati

Agenti polimerizzanti Ammonio persolfato e TEMED ( tetrametilenetilendimina) APS eTEMED catalizzano la decomposizione dello ione persolfato con la formazione del sorrispondente radicale libero S2O8 2- + e SO42-+ SO42-

Reazione tra Acrilammide e Radicale libero R. + A RA. RA. + A RAA. RAA. + A RAAA. E così via Catalisi radicalica R. = radicale dello ione persolfato A= monomero di acrilammide

Come possono essere regolate le dimensioni dei pori ? Variando la quantità di acrilammide usato Aumentando la quantità di Bis ( pori più stretti) Proteine più grandi sono ritardate nella migrazione Le più piccole migrano di più

Gel in gradiente Gel in cui la percentuale di acrilammide varia dal basso verso l’alto, così varia la porosità. Per separare proteine con PM molto vicino

SDS -PAGE Separare le proteine solo in base al loro PM SDS : ( ogni 2 aa si lega una molecola di SDS

Stacking gel E’ costituito da una piccola percentuale di acrilammide per assicurare un’alta porosità E’ tamponato con Tris HCl a pH 6,8 Lower gel Percentuale di acrilammide è più alta Tris HCL pH 8,8

Tampone di corsa Tris a pH 8,3 con Glicina Il campione + tampone contenente colorante( blu di bromofenolo), SDS e beta mercaptoetanolo viene caricato sullo stacking gel dopo bollitura

TECNICHE ELETTROFORETICHE

SDS-PAGE

RELAZIONE MOBILITA’ ELETTROFORETICA / MASSA PROTEINA

Elettroforesi in condizioni native Consente di separare la proteina in base alla sua attività biologica Non denatura la proteina Gel di poliacrilammide 7,5% senza SDS pH: 8.7 Separazione in base alla carica e setaccio molecolare del gel

Procedura Corsa elettroforetica Identificazione dell’Enzima di interesse: 1-Incubazione del gel in una soluzione contenente S in grado si fornire un P colorato in corrispondenza dell’E 2-Inclusione di S in un gel di agarosio che viene fatto polimerizzare sul gel si acrilammide Diffusione di E ed S tra i due gel produce bande colorate dove è presente E

IEF separazione in base al differente PI delle proteine Gel orizzontali montati su piastre si vetro o foglietti di plastica separazione su un gel in gradiente di pH Anfoline ( miscele di acisi poliammino-policarbossilici sintetici) Gel di poliacrilammide a basse concentrazioni(4%) o agarosio DDP alte 2500Volt x 2-3 ore la corsa è fatta su piastre refrigerate

Colorazione Gel viene lavato in TCA 10%, che fa precipitare e fissare le proteine ed lava gli anfoliti Colorazione in comassie decoloraione

Elettroforesi bidimensionale IEF in tubicini di vetro, in presenza di anfoliti urea 8M ed un detergente non ionico- Proteine denaturate si separano in base al loro PI il gel è estruso dai tubi e incubato in SDS in modo che il detergente si leghi alle proteine denaturate Gel posto su SDS-PAGE

Western Blotting Identificazione di una proteina di interesse in una miscela proteica totale Estrazione ed isolamento della proteina

Procedura SDS-PAGE Trasferimento su nitrocellulosa Incubazione con anticorpi specifici immunorivelazione

Trasferimento su nitrocellulosa Preparazione di un sandwich che contiene gel e nitrocellulosa Sandwich immerso in un tampone di trasferimento in una camera con elettrodi La corrente perpendicolare al gel trasferisce le proteine dal gel alla nitrocellulosa

Dopo il trasferimento Incubazione del blot con gelatina o latte o BSA Incubazione con anticorpi primari Lavaggi Incubazione con anticorpi secondari marcati in vario modo

Anticorpi secondari legati ad un E E legato all’anticorpo secondario è immerso in una soluzione contenente il S che si trasforma in un P colorato che precipita sulla proteina riconosciuta E : la fosfatasi alcalina o la perossidasi di rafano

Perossidasi alcalina BCIP (incolore) Prodotto blue 5-bromo-4-cloro-indolofosfato Perossidasi di rafano 4-cloro-1-naftolo P blue 3-ammino-9-etilcarbazolo P marrone

Enhanced chemiluminescence Perossidasi in presenza di H2O2 e luminolo, ossida il luminolo e produce luce, che viene rivelata su lastra fotografica Luminolo + H2O2 luminolo ossidato+ fotone perossidasi

Anticorpi secondari con isotopo radioattivi 125I Rivelazione per autoradiografia

Anticorpi secondari con fluoresceina Rivelazione: esponendo il blot alla luce UV Anticorpi secondari marcati con particelle d’oro Si colorano in rosso a contatto con Anticorpo primario

Gel di agarosio agarosio: polisaccaride lineare, formato dalla ripetizione di monomeri di agarobiosio e di galattosio e 3,6 anidro galattosio

Gel di agorosio Separazione di DNA o frammenti di acido nucleico in base alle loro dimensioni Perché si usa l’agarosio? DNA e i frammenti analizzati sono + grandi delle proteine Agarosio forma un gel a pori di dimensioni maggiori della poliacrilammide

Gel di agarosio Separa frammenti da 100 basi a 20kb Nel campione da separare si aggiunge etidio di bromuro , colorante che si intercala tra le basi ed è altamente fluorescente all’UV

Preparazione del gel di agarosio Agarosio 0,3% x separare DNA a doppio filamento di dimensioni tra 5-60kb Agarosio al 2% x separare DNA a doppio filamento di dimensioni tra tra 0,1-3kb Agarosio allo 0,8% x separare molecole tra 0,5 e 10kb

Procedura Agarosio è sciolto per bollitura in apposito tampone Versato su lastra di vetro o plastica circondato da nastro adesivo o da una vaschetta di plastica in modo che lo spessore sia di 3mm Pettine x pozzetti immerso nell’agarosio ancora liquido Pettine tolto quando l’agarosio è solidificato Gel immerso nella cameretta elettroforetica ricoperto di tampone Campioni sciolti in tampone (saccarosio e gliceroloe blu di bromofenolo) caricati nei pozzetti Corsa elettroforetica ON 1,5V/cm

Colorazione Gel immerso in una soluzione di etidio bromuro (0,5mg/ml), che si lega tra le coppie basi di DNA Dove ci sono frammenti di DNA il bromuro di etidio si concentra All’UV il bromuro di etidio rende fluorescente il DNA, producendo una luce rosso-arancio

L’elettroforesi su gel di agarosio L’elettroforesi su gel è una tecnica utilizzata per separare frammenti di DNA in funzione delle loro diverse dimensioni.

RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) Estrazione e purificazione del DNA Elettroforesi su gel di agarosio con bromuro di etidio Osservazione del gel ai raggi UV

Recupero del DNA dal gel: uso preparativo del gel di agarosio Bande vengono tagliate dal gel, e recuperate x elettroeluizione Bande sminuzzate e in tampone e centrifugate, nel surnatante si recupera il DNA

Elettroeluizione Bande poste in tubo da dialisi con tampone Tubo posto in una camera orizzontale con una maggiore quantità di tampone tra i due elettrodi Passaggio corrente stacca il DNA dal gel rRecupero del DNA nel tampone del tubo da dialisi

Isolameto dei frammenti di DNA x elettroeluzione Dopo elettroforesi la banda corrispondente al frammento che ci interessa viene rimosa dal gel Banda messa in un sacchetto da dialisi e immersa in una soluzione ad alto sale Recupero della banda

Southern Blotting Identificazione di un pezzo di DNA che vogliamo riconoscere Trasferimento del DNA dal gel alla nitrocellulosa Nitrocellulosa incubata con DNA radioattivo, cDNA come sonda che riconosce e lega la banda di DNA Autoradiogarfia

Schema trasferimento e ibridazione