I esercitazione II esercitazione III esercitazione IV esercitazione V esercitazione 5/11/15 pHmetro 9/11/15 Bradford 12/11/15 cromatografia 16/11/15 SDS-PAGE A 9.30 30/11/15 Saggio enzimatico? B 9.30 A 14.00 A 9,30 B 14.00 23/11/15 SDS-PAGE

Quando l’analita si muove in colonna, esso si distribuisce in una banda che presenta una distribuzione gaussiana In alcuni casi, però, il picco risulta asimmetrico, mostrando un allargamento sia della parte iniziale sia della parte finale (tailing) L’asimmetria dei picchi può essere dovuta a numerosi fattori Il caricamento in colonna di concentrazioni troppo elevate di analita L’imperfetto impaccamento della colonna La presenza di interazioni soluto-supporto Un’applicazione del campione mal eseguita

I calcoli sono più efficacemente eseguiti da integratori appositi Generalmente si assume che l’area sottesa da ciascun picco sia proporzionale alla quantità dell’analita corrispondente che è stato eluito L’area del picco può essere calcolata misurandone l’altezza e la sua larghezza a metà dell’altezza Il prodotto di queste due dimensioni si assume essere pari all’area del picco. In alternativa, si può ritagliare il picco dalla carta del registratore e pesarlo, assumendo che area e peso siano linearmente correlati I calcoli sono più efficacemente eseguiti da integratori appositi

Resa= Purezza = Attività specifica mg o U di proteina di interesse nella frazione mg o U di prot. di interesse all’inizio della purificazione Resa= mg di proteina di interesse nella frazione mg di proteine totali presenti nella frazione Purezza = U di proteina di interesse nella frazione mg di proteine totali presenti nella frazione Attività specifica =

La purificazione di una proteina richiede la disponibilità di un sistema per misurare la quantità di proteine totali nel campione: SAGGIO COLORIMETRICO

Determinazione della concentrazione proteica: METODO DEL BIURETO Soluzione di solfato di rame. In condizioni alcaline gli ioni rameici Cu2+ formano un complesso di coordinazione con quattro gruppi –NH presenti in legami peptidici Formazione di un complesso Assorbanza a 550 nm Cu2+ H Interazione degli ioni rameici con i legami peptidici metodo universabile e molto riproducibile Scarsa sensibilità: non adatto per campioni con concentrazioni inferiori ad 1 mg/ml Interferenza da parte dei sali ammonici: inutilizzabile su campioni proteici ottenuti per precipitazione con ammonio solfato (alte concentrazioni di ammonio)

METODO DI LOWRY reazione del biureto e riduzione, in condizioni alcaline, con il reagente di Folin-Ciocalteu il reattivo di Folin (sali di sodio degli acidi tungstico, molibdico e fosforico) reagisce, in presenza di ioni rameici, con i gruppi fenolici delle tirosine Il prodotto della reazione produce una colorazione blu/porpora, con un massimo di assorbimento a circa 750 nm interferenze da parte di Tris, HEPES ed EDTA curve di calibrazione lineari solo a basse concentrazioni proteiche tempi di incubazione precisi per ottenere dati riproducibili reazione che dipende dal pH (10 e 10.5) Poco costoso Di facile esecuzione Altamente riproducibile Molto sensibile (fino a 10 µg/ml)

METODO BCA (acido bicinconinico) reazione simile a quella del reattivo di Lowry Cu+2 ridotto a Cu+1 dalle proteine presenti in una soluzione alcalina Due molecole di BCA chelano uno ione rameoso (Cu+1) formazione di prodotto colorato in viola, con un max di assorbimento a 562 nm

sensibilità simile a quella del metodo di Lowry (10 µg/ml) ridotta suscettibilità alla presenza di detergenti dopo un’incubazione di 30 minuti a 37°C il colore è sufficientemente stabile per misurazioni attendibili (spostamento del 2,5% in 10 minuti) il colore continua a svilupparsi lentamente nel tempo diverse sostanze interferiscono con il metodo: triptofano, lipidi, rosso fenolo, cisteina, tirosina, saccarosio, glicerolo non puro, H2O2, acido urico, ferro

Metodo di Bradford (BLU COOMASSIE) Il blu coomassie è un colorante che quando si lega alle proteine cambia colore da marrone a blu La quantità di colorante che si lega è proporzionale alla quantità di proteina pertanto: L’intensità del colore blu è proporzionale alla concentrazione di proteina In genere quantità uguali di proteine differenti legano la stessa quantità di colorante, pertanto il saggio è indipendente dal tipo di proteina

il legame, in soluzioni acide, del Coomassie alle proteine determina uno spostamento del massimo di assorbimento del colorante da 465 nm (rosso) a 595 nm (blu) formazione di complessi non covalenti con le proteine tramite interazioni elettrostatiche con gruppi amminici e carbossilici e tramite forze di van der Waals soluzione stock in acido fosforico

semplicità di preparazione immediato sviluppo del colore elevata stabilità del complesso elevata sensibilità (fino a 22 µg/ml) compatibilità con molti tamponi, agenti denaturanti e preservanti Il reagente colora le cuvette ed è piuttosto difficile da rimuovere Alcune proteine non sono solubili nella miscela di reazione acida

1 mg/ml 2 mg/ml 4 mg/ml 8 mg/ml 16 mg/ml X mg/ml

DETERMINAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DELLA PROTEINA DI INTERESSE Intensità del colore blu Assorbanza a 595 nm 1 2 4 8 16 mg di proteina