Un tipico esempio LA CROMATOGRAFIA Principi di base e classificazione delle tecniche cromatografiche: un riepilogo DEFINIZIONE GENERALE Con il termine cromatografia si indica genericamente una tecnica di analisi e/o separazione di sostanze in miscela basata sulla differente distribuzione delle specie da separare tra una fase mobile, che può essere un liquido, un gas o un fluido supercritico ed una fase stazionaria immiscibile, eventualmente posta su di un supporto. Un tipico esempio

Breve storia della cromatografia 1900-06: Il botanico Mikhail Tswett osserva la separazione dei pigmenti di un estratto in etere di petrolio di foglie verdi per filtrazione su una colonna di carbonato di calcio e propone il termine CROMATOGRAFIA per questo metodo. 1938:Izmailov e Shraiber introducono il sistema di separazione su strato sottile. 1941:Martin e Synge sviluppano la cromato-grafia di ripartizione su colonna. 1944: Consden, Gordon, e Martin utilizzano la cromatografia di ripartizione su carta. 1950: Howard e Martin pubblicano le prime considerazioni applicative della cromatografia in fase inversa. 1952: James e Martin sviluppano la gas cromatografia. 1956: Lathe e Ruthvan usano setacci molecolari a base di amidi naturali e modificati per la determinazione del peso molecolare . 1964: J. C. Moore sviluppa applicazioni della cromatografia di permeazione su gel. 1960-70: Si sviluppano tecniche alla base della cromatografia liquida ad alta pressione.

Principi generali della cromatografia Fase Mobile B A Fase Stazionaria Le tecniche cromatografiche si basano sulla differenza di affinità dei composti da analizzare per la fase stazionaria e la fase mobile . Il rapporto di distribuzione,o rapporto di ripartizione o coefficiente di ripartizione per il componente A, è dove [AS] è la concentrazione di A in una unità di volume della fase stazionaria e [AM] è la concentrazione di A in una unità di volume della fase mobile. KA = [AS] / [AM]

Terminologia Colonna cromatografica: un tubo di vetro o plastica riempito con un solido attivo (adsorbente) La miscela da separare è applicata nella zona iniziale ed è eluita dal solvente o liquido di sviluppo. La risultante separazione in una serie di zone è il cromatogramma. Sistema cromatografico: è costituito dalla miscela da separare, adsorbente e solvente. Solvente fresco (eluente) Banda iniziale (2 componenti) Impaccamento della colonna (fase stazionaria) sospesa nel solvente (fase mobile) Disco poroso Eluato

Separazione di una miscela di due o più componenti lungo un percorso cromatografico I coefficienti di ripartizione saranno Ka<Kb<Kc

Potere eluente o di trascinamento della fase mobile Fattori che influenzano gli equilibri soluto, fase mobile, fase stazionaria. Potere eluente o di trascinamento della fase mobile Cromatografia liquida Gas Cromatografia Cromatografia con fluidi supercritici Temperatura Densità Composizione chimica

Fattore di separazione o selettività Descrizione di una separazione cromatografica Fattore di capacità K’= (tR-tM)/ tM Sostanza non ritenuta tempo di ritenzione del soluto (tR ) tM Fattore di separazione o selettività a = K’B/K’A Risoluzione R= 2 [tR(B)- tR(A)] / [Wh(A)+Wh(B)] ovvero 2 [tR(B)- tR(A)] / [Wb(A)/2+Wb(B)/2] Wh Fig 3.1.4. Wb

Efficienza di un sistema cromatografico La capacità di un sistema cromatografico di minimizzare l’allargamento della banda durante la migrazione del componente da separare viene definita Efficienza “N” o “n” N = 16 (tR / Wb)2 n = 5.54 (tR / Wh)2 Il modello dei piatti teorici Il concetto di piatto teorico è utile per definire in maniera quantitativa l’efficienza di un sistema cromatografico. I valori di N o n corrispondono al numero di piatti teorici Altezza equivalente ad un piatto teorico (HETP, Height Equivalent of a Theoretical Plate) in mm HETP=L/N

Esempio di come si calcolano i parametri fondamentali di un cromatogramma Le misure sono in mm. Se si desiderano i volumi basta moltiplicare per la velocità di flusso e dividere per la velocità del registratore. V0 = 29,0 mm V1 = 97,5 mm V2 = 128 mm W1 = 6.0 V3 = 152 mm V4 = 160 mm a1,2 = 128-29 = 1.45 97.5-29 a3,4 = 160-29 = 1.06 152-29 L = 300 mm

HETP=A+B/u+Cu Efficienza di una separazione cromatografica in funzione della velocità del flusso della fase mobile: l’equazione di Van Deemter HETP=A+B/u+Cu A: diffusione microvorticosa B: diffusione molecolare longitudinale C: resistenza al trasferimento di massa u: velocità lineare media del gas/fluido di trasporto

Effetti di diffusione

Effetto dei diversi parametri sulla risoluzione Per ottimizzare la risoluzione si può quindi: 1. Allungare la colonna o il percorso lungo la fase stazionaria aumento tempo di ritenzione, allargamento banda. 2. Ridurre HETP riducendo le dimensioni delle particelle della fase stazionaria 3. Modificare il fattore di capacità k’ variando la temperatura (GC) o la composizione della fase mobile (LC) E’ l’approccio più facile ed efficace. 4. Modificare il fattore di selettività a Variando la composizione della fase mobile Variando la temperatura della colonna Variando la natura della fase stazionaria Con additivi particolari nella fase mobile Il risultato è più difficile da prevedere e può verificato solo empiricamente.

Tecniche cromatografiche: criteri di classificazione. In base al tipo di fase mobile: Cromatografia Liquida (Liquid Chromatography, LC) Gas Cromatografia (Gas Chromatography, GC) Cromatografia supercritica (Supercritical Fluid Chromatography, SFC) In base al principio chimico fisico di interazione analita-fase stazionaria : Cromatografia di adsorbimento Cromatografia di ripartizione Cromatografia di scambio ionico Cromatografia di esclusione molecolare.

Principali tecniche cromatografiche

Attività allumina secondo Brockmann 1. Cromatografia di adsorbimento Fase mobile: liquido (o gas) Serie eluotropica dei solventi (secondo Trappe): Etere di petrolio< Cicloesano< Tetracloruro di Carbonio< Toluene< Diclorometano< Cloroformio <Etere etilico< Acetato di Etile<Acetone<Propanolo< Etanolo< Metanolo<Acqua<Acido Acetico Non deve: Reagire con l’adsorbente o l’analita Solubilizzare l’adsorbente Essere tossico o costoso Deve: avere basso p.e. per permettere facile recupero degli analiti separati Fase stazionaria: un solido attivo finemente suddiviso Attività allumina secondo Brockmann Non deve: Adsorbire irreversibilmente l’analita Solubilizzarsi nell’eluente Deve: permettere un facile percolamento eluente Affinità relativa delle varie classi di composti organici per fasi stazionarie adsorbenti Idrocarburi saturi< alchini, alcheni, idrocarburi aromatici< eteri< esteri, chetoni, aldeidi< ammine, tioli, alcoli< fenoli, acidi carbossilici.

Cromatografia su strato sottile o laminare (TLC) Rivelazione Diretta (per composti colorati) Assorbimento UV (254 , 366 nm) Fluorescenza Ossidazione spinta (CeIV; CrVI in acido solforico) Vapori di iodio Reattivi specifici cromogeni (es. ninidrina ) Fase stazionaria (silice, allumina) mescolata con un legante (gesso, amido) ed eventualmente un rivelatore di fluorescenza, su lastre di vetro, alluminio , poliestere. TLC bidimensionale TLC preparativa Su lastre 20x20 cm; spessore adsorbente 0.5, 1.0, 2.0 mm. Rivelazione non distruttiva Recupero composti separati

Cromatografia su colonna Granulometria della fase: Dimensioni delle particelle ( es. 0.2-0.3 mm) Intervalli di “mesh” ovvero numero di fori per pollice lineare (2.54 cm) di un setaccio che trattiene ovvero lascia passare completamente i granuli della fase. ( es 70-230 mesh) Rapporto in peso fase stazionaria/miscela da 1:20-50 fino a 1:100-200 per separazioni difficili Cromatografia Flash Tecnica introdotta da Still nel 1978 W. C. Still, M. Kahn and A. Mitra, J. Org. Chem. 1978, 43, 2923.

Cromatografia di ripartizione Fase stazionaria: Un film liquido adsorbito su un supporto inerte Fase mobile Fase mobile Gas GLC GLC Liquido Fase stazionaria polare (acqua, tamponi; acidi; metanolo) su silice, cellulosa. Fase mobile meno polare ButOH-CHCl3; ButOH-benzene; AcOEt, esano LLC LLC Cromatografia di ripartizione in fase diretta Fase stazionaria non polare (ottadecile, ottile, feniletil, cianopropile per derivatizzazione silice o cellulosa ) Fase mobile polare (MeOH, CH3CN, THF/acqua) Cromatografia di ripartizione a fasi invertite Cromatografia in fase inversa Esempi: cromatografia su carta; cromatografia di coppia ionica (IIC : ion interaction chromatography; IPC: ion pairing chromatography)

3. Cromatografia di scambio ionico Scambiatore ionico: sostanza capace di scambiare reversibilmente i propri ioni costituzionali con specie ioniche esterne che portano la stessa carica. Gli scambiatori ionici sono insolubili nei solventi contenenti gli ioni da scambiare e sono resistenti ad agenti chimici a T<100 °C. Devono essere preferibilmente duri e resistenti alle abrasioni. Di una resina scambiatrice si definiscono: grado cross linking; dimensioni particelle; la forma ionica; il gruppo scambiatore ionico Esempio Dowex 3-X4, 50-100 mesh, Cl- [RNH(CH3)2]+Cl-

Sequenza di selettività Uso delle resine scambiatrici ioniche Bisogna conoscere: Capacità minima, capacità totale per unità di peso Bisogna valutare: Il rigonfiamento della resina a contatto con le soluzioni acquose, inversamente proporzionale al grado di cross linking; Capacità di scambio della resina in funzione del pH La dimensione e la carica netta del soluto 0 2 4 6 8 10 12 14 pH Eluizione delle resine Sequenza di selettività Cationi Monovalenti:Li+<H+<Na+<NH4+<K+<Rb+<Cs+<Ag+ Cationi Divalenti:Cu2+<Cd2+<Ni2+<Ca2+<Pb2+<Ba2+ Anioni :F-<CH3COO-<HCOO-<Cl-<Br-<I-<NO3-<SO42-<citrato METODO DI ELUIZIONE In batch In colonna In continuo Il più utilizzato su colonna per scambiatori cationici forti è un gradiente di concentrazione di HCl

4. Cromatografia di esclusione/gel permeazione Non dipende da interazioni tra soluto, fase mobile e fase stazionaria Le fasi si comportano come vagli o setacci a dimensione controllata. Nell’attraversare la colonna le molecole sono trattenute in funzione della struttura/forma che assumono. Flusso del solvente Miscela da separare

Gel idrofili per SEC Gel lipofili per GPC Cromatografia di permeazione su gel (GPC): comprende tutte quelle applicazioni che utilizzano eluenti organici. Cromatografia di esclusione molecolare (SEC): si riferisce a quelle applicazioni che utilizzano eluenti acquosi. Gel idrofili per SEC Eluenti acqua, tamponi, alcoli Destrano: carboidrato complesso per trasformazione del saccarosio ad opera di Leuconostoc mesenteroides. Costituito da unità di glucosio unite per più del 90%da legami 1,6-glicosidici. Sephadex: catene di destrano unite da ponti di glicerolo. Sephadex LH-20: da acilazione o alchilazione dei gruppi OH del destrano. Biogel : dalla copolimerizzazione di acrilammide e N,N’-metilenbisacrilammide. Polimeri stirene-divinilbenzene: preparati per essere usati come setacci molecolari Gel lipofili per GPC Eluenti THF, DMF, toluene