Cromatografia ad esclusione molecolare -S.I.C.S.I. (VIII ciclo)- Laboratorio di chimica analitica Prof. S. Andini Cromatografia ad esclusione molecolare

Destinatari: alunni di una classe IV di un Istituto Tecnico ad indirizzo Chimico-biologico Tempi: 2 lezioni da 50 minuti + 1 esercitazione di laboratorio

Prerequisiti: Cenni di chimica organica, i legami chimici e le interazioni intermolecolari, generalità sulla cromatografia, TLC, cromatografia su gel di silice, spettroscopia UV-VIS e legge di Lambert-Beer Obiettivi: Conoscere il principio base della cromatografia ad esclusione molecolare ed applicazioni della tecnica

CROMATOGRAFIA Tecnica di separazione basata sulla diversa affinità che i componenti di una miscela possono manifestare nei confronti di determinate sostanze o materiali. I vari componenti di una miscela tendono a ripartirsi in modo diverso tra due fasi.

Una fase rimane fissa (la fase stazionaria), ed è generalmente un solido o un gel, un'altra fase, liquida o gassosa, (la fase mobile) fluisce su di essa trascinando con sé in quantità maggiore i componenti della miscela che le risultano più affini.

Quando fu scoperta la Cromatografia Quando fu scoperta la Cromatografia? (dal greco: chroma, colore + graphein, scrivere) Scoperta da un botanico russo per separare i pigmenti delle foglie mediante l’uso di assorbenti solidi Le tecniche cromatografiche sono particolarmente utilizzatein biochimica per la separazione di proteine e di acidi nucleici. La cromatografia nell'analisi degli amminoacidi fu applicata dal dott. Martin e dal dott. Synge. Essi effettuarono l'analisi con fogli di carta e vari solventi. La cromatografia su carta sfrutta la suddivisione di un soluto tra due solventi (l'acqua presente nella carta e il solvente usato, ad esempio l'alcool etilico). E' una tecnica semplice per l'identificazione degli amminoacidi

Cricamento del prodotto Camera di sviluppo

Cromatografia su colonna La cromatografia su colonna è un sistema analogo alla TLC, ma gravitazionale per cui le sostanze che “corrono” di più si trovano nel basso della colonna e vengono eluite per prime.

Cromatografia di adsorbimento su colonna (in fase diretta)

Cromatografia per gel filtrazione o esclusione molecolare Si basa sulle diverse dimensioni dei soluti da separare Granulo di resina pori Miscela da separare Beaker di raccolta

Le molecole piccole penetrano dentro i granuli di gel e sono ritardate Le molecole più grandi eluiranno più velocemente

Fase stazionaria: granuli di gel idratato poroso (chimicamente inerte) Fase mobile: solvente I soluti di dimensioni minori possono penetrare nei pori, e migrano più lentamente I soluti le cui dimensioni superino il diametro dei pori (limite di esclusione), ne rimangono esclusi, e passano più velocemente attraverso gli spazi interstiziali dei granuli

Esclusione Molecolare Frazioni E’ tra i metodi di separazione più “gentili” grazie alla mancanza di interazioni chimiche con la resina

Sono commercialmente disponibili diversi tipi gel polimerici, a seconda del LIMITE DI ESCLUSIONE e dell’ INTERVALLO o CAMPO DI FRAZIONAMENTO Nome commerciale Materiale Campo di frazionamento (kD) Sephadex G-10 Destrano 0.05 - 0.7 Sephadex G-25 Destrano 1 - 5 Sephadex G-50 Destrano 1 - 30 Sephadex G-100 Destrano 4 - 150 Sephadex G-200 Destrano 5 - 600 Bio-Gel P-2 Poliacrilammide 0.1 - 1.8 Bio-Gel P-6 Poliacrilammide 1 - 6 Bio-Gel P-10 Poliacrilammide 1.5 - 20 Bio-Gel P-30 Poliacrilammide 2.4 - 40 Bio-Gel P-100 Poliacrilammide 5 - 100 Bio-Gel P-300 Poliacrilammide 60 - 400 Sepharose 6B Agarosio 10 - 4000 Sepharose 4B Agarosio 60 - 20000 Sepharose 2B Agarosio 70 - 40000 Il limite di esclusione è il peso molecolare della più piccola molecola incapace di penetrare nei pori del gel, per cui ne viene esclusa. L’intervallo di frazionamento è l’intervallo dei pesi molecolari delle molecole frazionate. Il limite superiore è costituito proprio dal limite di esclusione.

Struttura del destrano Fasi stazionarie Sephadex Struttura del destrano E’ un carboidrato polimerico ramificato. La ramificazione determina le dimensioni dei pori della matrice.Può essere ulteriormente ramificato impiegando epiclorina Epicloridrina: I gruppi idrossilici del destrano si legano con le molecole di acqua e si forma il gel. Variando la percentuale di legami crociati tra le molecole di destrano si sono ottenuti i vari tipi di Sephadex che differiscono tra loro per la grandezza dei pori e che pertanto possono essere usati in un ampio intervallo di pesi molecolari. In ciascun tipo di gel si osserva una certa variabilità della grandezza dei pori dovuta alla distribuzione casuale dei legami crociati, ed è per questo che molecole che, in teoria, dovrebbero essere escluse dal gel, possono penetrarvi parzialmente. Ciascun tipo di Sephadex è inoltre caratterizzato dal suo coefficiente di rigonfiamento, cioè dalla quantità d'acqua assorbita da un grammo di peso secco di gel per giungere a completo rigonfiamento. Permettono la separazione di molecole sferoidali, come le proteine globulari Sephadex LH-20 I gruppi idrossilici sono alchilati Limiti di esclusione 0.7-800 KDa

Struttura della poliacrilammide Fasi stazionarie Bio-Gel Struttura della poliacrilammide E’ un polimero di acrilamide e N,N’-metilenbisacrilamide (quest’ultimo determina la formazione di legami crociati). E’ disponibile in commercio come Bio-GelP, con limiti di esclusione tra 0.2 e 400 kD. Il cosiddetto Sephacryl e’ destrano con legami crociati ottenuti con N,N’-metilene bisacrilamide. L’acrilammide polimerizza in presenza di radicali liberi forniti da un iniziatore di radicali l’ammoniopersolfato.ll TEMED funziona da catalizatore di reazione.

Struttura dell’ agarosio Fasi stazionarie Sepharose Struttura dell’ agarosio E’ un polisaccaride derivante da particolari alghe rosse ed è costituito da residui alternati di D-galattosio e 3,6-galattosio anidro Limiti di esclusione 10-40000 KDa cellulosa Lo stato di gel dell’agarosio dipende dalla formazione di legami idrogeno intramolecolari e intermolecolari. Grazie alla loro natura idrofila e all'assenza di gruppi carichi, i gel di destrano e di agarosio hanno uno scarsissimo effetto di denaturazione e di adsorbimento di composti biochimici labili. Dotati di una più larga porosità, i gel di agarosio completano il campo dei gel di destrano. Epicloridrina:

Come si prepara una colonna cromatografica? Scelta della fase stazionaria. La resina è venduta in forma DISIDRATATA. È necessario perciò idratare la resina (RIGONFIAMENTO) con acqua o con il solvente della miscela proteica. Il caricamento della colonna va effettuato lentamente, onde evitare la formazione di bolle d’aria. Si sovrappone alla fase stazionaria la soluzione della miscela proteica da separare Si fa fluire la fase mobile (soluzione tampone) per gravità Si raccoglie l’eluato in provette e lo si analizza attraverso un rivelatore, in genere uno spettrofotometro

Come facciamo a conoscere quali frazioni contengono le proteine? Le proteine totali possono essere identificate misurando l’assorbanza a 280 nm in uno spettrofotometro grazie alla capacità degli aminoacidi aromatici di assorbire la luce a questa lunghezza d’onda. Grafico di eluizione Frazione Picchi A280 Frazione 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 2 5 8 A280 Quanto più sono lontani i picchi tanto più la matrice è selettiva nei confronti del campione

Quali frazioni contengono la proteina di interesse? Si può misurare l’attività enzimatica eseguendo un dosaggio su ciascuna frazione che contiene proteine; l’attività maggiore misurata è generalmente in corrispondenza di picchi. Frazione 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 2 5 8 A280 Risultati del dosaggio E’ possibile a questo punto scartare I tubi dove non è presente l’attività di interesse e riunire quelli in cui è presente attività A280 Frazione #

Applicazioni della cromatografia ad esclusione molecolare Purificazioni Determinazione Mr Dissalazione Concentrazione Dal momento che le proteine e altre macromolecole biologiche hanno dimensioni molto piu’ grandi rispetto ai sali e ad altre piccole molecole, questa tecnica e’ particolarmente efficiente per • rimozione di sali • cambio di buffer • rimozione di marcatori (ad es. radioattivi) dalle macromolecole marcate Soluzioni di sostanze ad alto peso molecolare possono essere concentrate aggiungendo Sephadex G-25 secco Esempi di sostanze purificate con questa tecnica: proteine, enzimi, ormoni, anticorpi, acidi nucleici, polisaccaridi. Molto usata anche per separare le forme monomeriche da quelle polimeriche. Stima della massa molecolare

La filtrazione su gel puo’ essere usata per stimare la massa molecolare Elution time or volume Log Molecular weight

La filtrazione su gel puo’ essere usata per stimare la massa molecolare Cromatografia su Sephadex G-200. Volume di eluizione relativo verso il logaritmo della massa molecolare. Le proteine arancioni sono glicoproteine.