CROMATOGRAFIA L'invenzione della cromatografia viene attribuita al biochimico russo Mikhail Cvet che riuscì, nel 1906, a separare la clorofilla da un estratto vegetale Con il termine cromatografia oggi si indicano tutte le varie tecniche preparative e/o analitiche che si basano sulla distribuzione fra due fasi: una fase stazionaria (fissa) ed una mobile che passa attraverso la fase stazionaria

Matrici utilizzate SUPPORTO INERTE PER LA FASE STAZIONARIA Agarosio Polisaccaride cosituito da residui alternati di D-galattosio e 3,6-anidro-L-galattosio. Disponibile commercialmente come Sepharose, Superose, Bio-Gel A Limiti di esclusione 10-40000 kDa Cellulosa Polimero di unita’ glucosidiche unito da legami -1,4 (legami crociati tramite epicloridrina) Destrano Polimero di residui di glucosio uniti da legami -1,6. E’ presente in commercio con il nome di Sephadex (legami crociati tramite epicloridrina). Limiti di esclusione 0.7-800 kDa. Il Sephacryl e’ costituito da destrano che forma legami crociati con N,N’-metilene bisacrilammide. Limiti di esclusione 1-8000 kDa. Il Superdex e’ un gel composito costituito da destrano covalentemente legato ad agarosio Poliacrilammide Polimero di acrilammide e N,N’-metilenbisacrilammide. Disponibile in commercio come Bio-Gel P, limiti di esclusione tra 0.2 e 400 kDa Polistirene Polimero di stirene legato con divinilbenzene Silice Polimero prodotto a partire dall’ acido ortosilicico. I molti gruppi silanolo (Si-OH) rendono la matrice altamente idrofilica

Cromatografia f. stazionaria f. mobile Gel filtrazione solida-porosa liquida Scambio ionico solida- liquida gruppi carichi Affinità solida- liquida ligando immobilizzato Fase inversa liquida liquida/ gassosa

CROMATOGRAFIA AD ESCLUSIONE MOLECOLARE: GEL FILTRAZIONE Consente la separazione di molecole in base alle loro dimensioni Il termine gel filtrazione è impiegato per descrivere la separazione di molecole di diverse dimensioni utilizzando gel (composti organici polimerici che possiedono una rete tridimensionale di pori che conferisce loro le proprietà di un gel) FASE STAZIONARIA solida – porosa FASE MOBILE liquida

CROMATOGRAFIA per FILTRAZIONE su GEL (GEL FILTRAZIONE) Nessuna interazione chimica tra le particelle di resina e le proteine - Le particelle di resina fungono da setacci molecolari

Cromatografia per gel filtrazione Sopranatante dell’omogenato cellulare Cromatografia per gel filtrazione Resina SEPHADEX G-75 capacità di separazione 5-70 KDa

RESINA: Destrano Polimero di residui di glucosio uniti da legami -1,6 che presenta legami crociati con epicloridrina. Limiti di esclusione 0.7-800 kDa

Pompa peristaltica Colonna Collettore di frazioni

Al termine della cromatografia si legge l’assorbanza nell’ultravioletto (alla lunghezza d’onda di 278 nm) di tutte le frazioni ottenute Riportando in grafico i valori di assorbanza in funzione del numero delle frazioni (o del volume eluito) si ottiene il cromatogramma

CROMATOGRAMMA Assorbanza 278 nm n° frazione

Attività Specifica Concentrazione proteica totale N° della frazione (o volume dell’eluato)

VTOT della matrice (incluso ed escluso) Per una gel filtrazione si stabilisce il VTOT della matrice (incluso ed escluso) Il VI è la quantità di tampone necessario a fare passare una sostanza attraverso la colonna, quando la sostanza è talmente piccola da passare attraverso i pori del gel Il V0 è la quantità di tampone necessario a fare passare una sostanza attraverso la colonna, quando essa è talmente grande da non passare tra i pori del gel Il Ve è il V a cui una determinata sostanza viene eluita

Identificazione del PM di una proteina sconosciuta LogPM Volume di eluizione

Cromatografia su colonna E’ il metodo cromatografico maggiormente adoperato La fase stazionaria è immobilizzata su una matrice adatta (un supporto inerte ed insolubile) ed impaccata all’interno di una colonna di vetro o di metallo La fase mobile liquida è fatta passare nella colonna per gravità, tramite un sistema di pompe, oppure applicando gas sotto pressione Si può pensare che una colonna cromatografica consista di un numero di zone adiacenti in ognuna della quali c’è spazio sufficiente perchè un analita si equilibri completamente tra le due fasi

Il campione, costituito da una miscela di molecole, passa attraverso la fase stazionaria miscelato alla fase mobile Le molecole saranno più o meno ritardate durante la corsa cromatografica in base alla loro attrazione per la fase stazionaria [campione] nella fase A [campione] nella fase B Kd= Coefficiente di partizione o di distribuzione (Kd) definisce come un composto si distribuisce tra due fasi non miscibili

5 cm Kd=1 h della colonna= 5 cm, riempita con una fase stazionaria solida e circondata da una fase mobile liquida (1 cm3 per cm di colonna) Sono applicati 32 mg di un certo composto disciolti in 1 cm3 di fase mobile Quando questo volume passa ad occupare la posizione A, 1 cm3 di fase mobile uscirà dalla base della colonna

Kd = 1 5 cm Se un altro cm3 di fase mobile viene introdotto in colonna, la fase mobile che era in A si sposterà in B, portando con sé 16 mg di composto e lasciandone una quantità uguale in A (stadio 2). Sia in A che in B, però, si avrà una ridistribuzione del composto tale che ci saranno 8 mg nella fase stazionaria ed 8 mg nella fase mobile. Aggiunte ulteriori della medesima quantità di fase mobile daranno le distribuzioni mostrate negli stadi 3, 4 e 5. Dopo un numero relativamente basso di equilibramenti, il composto si distribuisce simmetricamente a formare una banda

PIATTO TEORICO: tratto di colonna nel quale una specie chimica si trova in equilibrio fra le due fasi (stazionaria e mobile) prima che l’eluente la trascini ad uno stadio successivo

Un picco ben risolto non e’ l’equivalente di una sostanza pura Effetto del numero di piatti teorici (N) sulla distribuzione del soluto Un picco ben risolto non e’ l’equivalente di una sostanza pura

A parità di volume di gel colonne più lunghe e strette determinano una separazione migliore (risoluzione) di proteine simili

ELEMENTI DELLA CROMATOGRAFIA SU COLONNA Serbatoio per la fase mobile Dispositivo che consente l’identificazione degli analiti a mano a mano che essi lasciano la colonna nell’eluato Registratore Raccoglitore di frazioni

Allontanamento dei sali Le colonne Sephadex G-25 possono essere utilizzate per dissalare soluzioni di composti ad alto peso molecolare Le sostanze ad alto peso molecolare sono escluse dai pori, mentre i composti a basso peso molecolare si muovono lentamente Tale metodo è adoperato per allontanare l’ammonio solfato da preparazioni proteiche ed i sali dai campioni eluiti dopo cromatografia a scambio ionico

GEL-FILTRAZIONE VANTAGGI: Semplice nell’esecuzione Prevedibile Eluizione nel tampone di partenza Bassa capacità (piccoli volumi) Sovrapposizione dei picchi Diluizione del campione SVANTAGGI: