" Metodo, usato primariamente per la separazione dei componenti di un campione, in cui i componenti vengono distribuiti tra due fasi, una delle quali è fissa mentre l'altra è mobile. La fase stazionaria può essere un solido, o un liquido supportato su un solido, o un gel. La fase stazionaria può essere impaccata in una colonna, distribuita a formare uno strato, o distribuita come un film, etc.; in queste definizioni "letto cromatografico" è usato come termine generale per denotare una qualsiasi delle varie forme in cui può essere usata la fase stazionaria. La fase mobile può essere un gas o un liquido. " " Metodo, usato primariamente per la separazione dei componenti di un campione, in cui i componenti vengono distribuiti tra due fasi, una delle quali è fissa mentre l'altra è mobile. La fase stazionaria può essere un solido, o un liquido supportato su un solido, o un gel. La fase stazionaria può essere impaccata in una colonna, distribuita a formare uno strato, o distribuita come un film, etc.; in queste definizioni "letto cromatografico" è usato come termine generale per denotare una qualsiasi delle varie forme in cui può essere usata la fase stazionaria. La fase mobile può essere un gas o un liquido. " Laboratorio di Biochimica Separazione di aminoacidi mediante cromatografia su strato sottile (TLC) PROBITO ITS aa La cromatografia viene definita dalla IUPAC ( International Union of Pure and Applied Chemistry ): ciascuna componente è ritardata in funzione della sua interazione con la fase stazionaria, fase fissa, e con la fase mobile, eluente il flusso del solvente porterà ogni sostanza dal punto di applicazione verso l’estremità opposta della fase stazionaria se il composto non interagisce con la fase stazionaria migra con il fronte del solvente (altrimenti, se trattenuto, subisce un rallentamento)

Separazione di aminoacidi mediante cromatografia su strato sottile (TLC) Cromatografie a confronto:

o La fase stazionaria è costituita da un solido poroso polare come silice (acida) o allumina (basica) depositata su di uno strato di alluminio o vetro; o La fase eluente è costituita da una miscela di solventi organici apolari che migrano lungo la lasta per capillarità; o La miscela da separare è adsorbita o "seminata" alla base della lastra ed immersa nella fase mobile in una camera di sviluppo. o La fase stazionaria è costituita da un solido poroso polare come silice (acida) o allumina (basica) depositata su di uno strato di alluminio o vetro; o La fase eluente è costituita da una miscela di solventi organici apolari che migrano lungo la lasta per capillarità; o La miscela da separare è adsorbita o "seminata" alla base della lastra ed immersa nella fase mobile in una camera di sviluppo. Separazione di aminoacidi mediante cromatografia su strato sottile (TLC) La cromatografia planare (TLC) ( Thin Layer Chromatography ) è una tecnica in cui:

Valutazione degli Rf (fattore di ritenzione) Separazione di aminoacidi mediante cromatografia su strato sottile (TLC) Come si esegue una TLC Tracciare la linea di partenza (linea di deposizione) con una matita Per mezzo di un capillare deporre alcune gocce delle soluzioni delle diverse sostanze Porre la lastrina nella camera di eluizione contenente la miscela eluente opportuna Quando il solvente ha raggiunto i bordo superiore della lastrina, la si estrae e si segna a matita il fronte del solvente Si analizza la lastrina con un opportuno metodo: -analisi visiva -esame della lastrina sotto lampada UV -lastrina immersa in reattivi tali da colorare le macchie -e non la fase stazionaria- (H 2 SO 4, vapori di iodio, ninidrina, …)

Separazione di aminoacidi mediante cromatografia su strato sottile (TLC) Reazione della ninidrina La ninidrina (2,2-diidrossi-1,3-diossoidrindene) reagisce con gli amninoacidi: 2

Separazione di aminoacidi mediante cromatografia su strato sottile (TLC) Fattore di ritenzione Rf Rf (A) = Per ogni composto: Il valore di Rf di un composto è una costante fisica, per quelle determinate condizioni cromatografiche di eluente e fase stazionaria, e può servire a caratterizzare quel composto. Rf = distanza percorsa dalla sostanza distanza percorsa dal solvente d (A) d solvente Rf (B) = d (B) d solvente distanza percorsa dal solvente d (A) A d (B) B