1 L’immunologia è lo studio della risposta immunitaria, ciò del processo tramite il quale un animale si difende dall’invasione di organismi estranei. Le risposte immunitarie possono essere distinte in due gruppi: 1) immunitaria umorale (mediata da anticorpi); 2) immunitaria cellulare (mediata da cellule). Entrambi i tipi di risposta coinvolgono cellule del sistema reticolo-linfocitario. Le tecniche immunochimiche impiegano gli anticorpi che partecipano all’immunità umorale. Immunochimica: il rapporto antigene-anticorpo

2 Antigene Antigene  qualsiasi sostanza capace, dopo essere penetrata nei tessuti di un vertebrato superiore, di indurre una specifica risposta di difesa immunitaria. Proprietà: immunogenicitàimportanti dal punto di vista antigenicitàimmunochimico Immunogenicità: capacità di indurre una risposta immunitaria e/o cellulare Antigenicità: capacità di reagire in maniera specifica con i prodotti finali delle risposte immuni (anticorpi e/o recettori di membrana) L’antigenicità di una molecola non può essere considerata come una proprietà inerente alla molecola stessa, come lo sono le sue caratteristiche chimico-fisiche, bensì come una proprietà dipendente dalle condizioni sperimentali in cui viene determinata.

3 Da che cosa dipende l’immunogenicità di una sostanza? 1 - estraneità: il sistema immunitario è in grado di discriminare il “self” dal “non self”, di conseguenza, le molecole estranee ad un determinato organismo hanno capacità immunogena; 2 - peso molecolare: più è elevato il peso molecolare della molecola in esame e maggiore sarà la possibilità di avere una risposta immunogenica; 3 - complessità chimica e strutturale delle molecole: l’eterogenicità chimica apporta immunogenicità. Ad esempio omopolimeri anche adeguatamente grandi hanno immunogenicità bassa se confrontata con polimeri, contenenti aminoacidi diversi, dello stesso peso molecolare. D’altra parte, gli antigeni proteici risultano tanto più immunogenici quanto più sono complessi i loro livelli di organizzazione molecolare (struttura terziaria e quaternaria); 4 - specie animale: le proprietà immunogene di un antigene variano a seconda della specie animale utilizzata per la produzione di anticorpi; 5 – degradabilità: macromolecole insolubili sono più immunogene di quelle più piccole e solubili, poiché vengono più facilmente fagocitate ed elaborate dal sistema macrofagico.

4 Tutti gli antigeni si legano agli anticorpi utilizzando piccole zone superficiali e specifiche dette determinati antigenici o epitopi. Ma tutte le sostanze sono antigeniche? No, infatti esistono piccole sostanze organiche, dette apteni, monovalenti (con un unico determinante antigenico), antigeniche, ma non immunogeniche. possono venire legate artificialmente in modo covalente ad una proteina che prende il nome di carrier e funzionare come epitopi naturali. Teoricamente ogni entità chimica può di per sé contenere un determinante antigenico se legato ad un opportuno carrier immunogeno.

5 Anticorpo Gli anticorpi sono proteine che vengono prodotte dai linfociti B. Questi linfociti sono cellule piccole, rotonde, appartenenti alla categoria dei globuli bianchi con il compito di difendere l'organismo da agenti esterni tramite la risposta umorale. Esistono cinque classi di anticorpi che appartengono alla categoria delle molecole proteiche dette "Immunoglobuline". La loro produzione, da parte delle cellule plasmatiche, è provocata dall’introduzione nell’organismo di una sostanza estranea od antigene (Ag) avente determinate caratteristiche fisico- chimiche, che, riconosciuta poi per queste particolarità dai siti di combinazione dell’anticorpo, viene da questo legata, neutralizzata e quindi eliminata.

6 Che struttura ha un anticorpo? Essi hanno una struttura fondamentale composta da quattro catene polipeptidiche: due catene leggere identiche (a basso peso molecolare, definito Fc - Fragment crystallisable) e due pesanti ad alto peso molecolare (chiamati Fab - Fragment antigen binding). Agli estremi delle catene c'è o un gruppo carbossil- terminale COO- o il gruppo ammino-terminale NH 3+ che ha il compito di legarsi all'antigene specifico. Fab  “catena pesante” o C H, ovvero di peso molecolare maggiore, responsabile dell’attività biologica dell’anticorpo Fc  “catena leggera o CL, ovvero a peso molecolare minore, corrispondono alle regioni deputate al legame con l’antigene (dette paratopi) Queste catene sono legate tra loro da legami disolfuro intercatena.

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8 Come si producono gli anticorpi?  Immunizzazione di animali, previa coniugazione degli antigeni con molecole ad alto peso molecolare per incrementare la risposta immunogenica  Stima dell’effettiva presenza e determinazione del titolo e dell’affinità degli anticorpi prodotti mediante saggio ELISA spettrofotometrico  Purificazione e caratterizzazione degli anticorpi  La specificità del sito di legame con l’antigene di ciascuna immunoglobulina dipende dalla variazione di alcuni residui amminoacidi nella porzione N-terminale di ciascuna catena (regione variabile) e spiega l’unicità di ciascun anticorpo specifico. Immunizzazione mediante iniezione di topi e/o conigli Saggio ELISA spettrofotometrico (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

9 Interazione antigene-anticorpo IMMUNOCOMPLESSO L’unione che si instaura tra un antigene ed il corrispondente anticorpo porta alla formazione di quello che viene definito IMMUNOCOMPLESSO. Tale unione è altamente specifica ed è regolata da forze di tipo chimico-fisico (legami di natura non covalente) che agiscono tra i determinanti dell’antigene e dell’anticorpo. La formazione degli immunocomplessi determina una serie di eventi effettori finalizzati alla definitiva distruzione o neutralizzazione dell’antigene. Sistema chiave-serratura Di fronte all’agente da riconoscere, che funziona da serratura, il sistema immunitario ricorre ad un metodo apparentemente dispendioso, quello di costruire a caso un elevato numero di chiavi differenti tra le quali ci sarà senza dubbio quella giusta per aprire la serratura. Tali chiavi sono gli anticorpi naturali che rappresentano il bagaglio cognitivo del sistema immunitario ed i principali fautori della resistenza naturale di specie o di razza verso particolari agenti estranei.

10 Un principio fondamentale su cui si basa l’interazione antigene-anticorpo (Ab-Ag) per la formazione del complesso antigene-anticorpo (Ag- Ab). L’equilibrio fra antigene monovalente (aptene) e l’anticorpo viene espresso dalla legge di massa: k 1 Ab + Ag Ab-Ag k 2 e, ad equilibrio raggiunto, K= k 2 /k 1 = [Ab- Ag]/[Ab][Ag].

11 Quando, per una determinata concentrazione di Ag, [Ag-Ab] = [Ab], cioè i siti antigenici dell’anticorpo, sono saturati per metà con l’antigene, allora il valore del reciproco della concentrazione dell’antigene libero sarà uguale alla costante di affinità: K = 1/[Ag]. La costante K (costante di associazione) è definita dalla concentrazione di epitopo libero necessario perché venga raggiunto il 50% di saturazione dei siti anticorpali ed una misura dell’affinità intrinseca o della stabilità del legame Ag-Ab.

12 Il valore della costante di affinità di un anticorpo per un dato antigene determina negli esperimenti immunochimici sia il limite di rilevabilità (che migliora con l’aumentare dell’affinità), sia la specificità (che cresce all’aumentare della differenza tra il valore della costante di affinità di un Ab verso l’Ag specifico ed quello relativo ad un Ag non). Le K aff possono variare da 10 9  M -1 nel caso di anticorpi con elevata affinità per l’antigene, a 10 4  10 5 M -1 nel caso invece di immunoglobuline con bassa affinità.

13 Affinità: forza dell’interazione antigene-anticorpo (o aptene-anticorpo) misurata dalla costante di equilibrio della reazione di associazione Reazione antigene-anticorpo: reazione dinamica e reversibile tra un anticorpo e un antigene per dare origine al complesso antigene-anticorpo. E’ caratterizzata da una costante di equilibrio definita. Immunogeno: sostanza antigenica (antigene, coniugato aptene-proteina) che in contatto con un ospite immunocompetente è capace di stimolare la produzione di anticorpi specifici. Sito legante anticorpale (paratopo) : regione della molecola anticorpale capace di combinarsi con il corrispondente determinante antigenico. Determinante antigenico (epitopo) : elemento strutturale della molecola antigenica riconosciuto dall’anticorpo e capace di combinarsi con il corrispondente sito legante anticorpale. Marcatore: sostanza (radioisotopo, enzima, fuoroforo ecc) che introdotta nella struttura di un reagente (antigene, aptene, anticorpo) ne consente la rivelazione

14 Tecniche immunoenzimatiche La specificità delle reazioni antigene-anticorpo e la sensibilità di “marcatori” (isotopi, sostanze fluorescenti, radicali liberi, enzimi) possono essere combinate insieme per compiere un “dosaggio immunologico”, ossia quantificare con precisione una sostanza antigenica. La tecnica più usata è il dosaggio radioimmunologico (RIA), in cui il tracciante è costituito da un isotopo. Vantaggi: - elevata sensibilità, della facilità con cui si ottengono le marcature isotopiche -invariabilità delle cinetiche di reazione a seguito della marcatura stessa. Svantaggi: - alti costi dei reattivi e delle apparecchiature, -deperibilità, pericolosità e difficoltà di smaltimento dei composti radioattivi, - necessità di personale specializzato.

15 Quando il tracciante è costituito da un enzima, si parla di dosaggi immunoenzimatici (EIA). In questo caso non viene misurato direttamente il marcatore, ma la sua attività nei confronti di un suo substrato specifico (ovvero la quantità di prodotto formato). È da tener presente che l’attività enzimatica, come pure l’affinità fra Ab e Ag, può variare a seguito della coniugazione fra enzima e anticorpo (o antigene). Vantaggi: - minor costo, -assenza di rischi derivati dall’esposizione a radiazioni, - maggior praticità e versatilità.

16 Saggio ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Prevede l’uso di un enzima coniugato ad uno dei biocomponenti utilizzati nel test, susseguentemente l’addizione di un substrato e la sua trasformazione in un prodotto colorato, permetterà di quantificare il reagente legato indirettamente all’enzima tramite lettura con un opportuno spettrofotometro, e quindi, di risalire alla stima dell’analita in esame. Saggio competitivo: saggio immunochimico basato sulla competizione tra analita e tracciante per l’occupazione di un numero limitato di siti leganti anticorpali: consiste in pratica nella misura dei siti non occupati dall’analita. Tracciante: indicatore della reazione analitica nei saggi immunochimici. Sostanza (antigene, anticorpo, aptene) resa direttamente rivelabile mediante l’introduzione di un opportuno marcatore.

17 Procedura test ELISA

18 Saggio competitivo diretto uso del coniugato Antigene-Enzima Una quantità fissa di antigene marcato e diluizioni decrescenti di antigene libero (come standard o nel campione) vengono messe a reagire insieme nei confronti di un anticorpo in difetto. In questo modo, l’antigene marcato e libero si troveranno a competere per un numero limitato di siti anticorpali. Dopo aver lavato il complesso, si aggiunge il substrato per l’enzima e si misura l’attività enzimatica spettrofotometricamente, fluorimetricamente o mediante chemioluminescenza. La concentrazione del prodotto enzimatico misurata risulterà inversamente proporzionale alla concentrazione dell’analita.

19 Saggio competitivo diretto uso del coniugato Anticorpo-Enzima Questo tipo di saggio competitivo coinvolge l’uso del coniugato anticorpo-enzima, con l’antigene immobilizzato sulla fase solida. La reazione di competizione avviene fra l’antigene immobilizzato e quello libero in soluzione come standard o proveniente dal campione, nei confronti dell’anticorpo marcato presente in concentrazione fissa e in difetto. La misura del prodotto della reazione enzimatica sarà indirettamente proporzionale alla concentrazione di antigene presente nel campione.

20 Saggio competitivo indiretto uso di un anticorpo secondario La procedura implica l’uso di un anticorpo secondario marcato, in grado di riconoscere la regione costante dell’anticorpo primario, precedentemente incubato su fase solida. La reazione di competizione avviene fra l’antigene immobilizzato e quello libero in soluzione come standard o proveniente dal campione, nei confronti dell’anticorpo presente in concentrazione fissa. La misura del prodotto enzimatico sarà direttamente proporzionale nel caso della misura del titolo dell’anticorpo da determinare, mentre inversamente proporzionale per l’analita.

21 Saggio non competitivo Saggio ELISA a sandwich Questa metodica può essere utilizzata esclusivamente quando l’analita possiede almeno due determinanti antigenici. Un eccesso di anticorpo verso il primo sito antigenico viene immobilizzato sulla fase solida e incubato con diluizioni successive di antigene presente nel campione o in soluzioni standard. Dopo il lavaggio, il complesso Ag-Ab immobilizzato viene incubato con una concentrazione fissa di anticorpo marcato che andrà a legarsi al secondo sito antigenico dell’immunocomplesso. La misura del prodotto della reazione enzimatica risulterà direttamente proporzionale alla concentrazione dell’antigene da stimare.

22 Fattori che influenzano la scelta del metodo Le tecniche ELISA non competitive offrono una maggiore sensibilità rispetto alle competitive. La rilevabilità finale di un’analisi competitiva è limitata dalla costante di affinità dell’anticorpo usato. La sensibilità finale dei saggi non competitivi è determinata dal binding non specifico degli immunoreagenti marcati. Nei saggi competitivi diretti, dipende dal grado di purezza e dalla stabilità degli immunoreagenti, Ag o Ab, marcati con l’enzima. Quando di lavora con campioni reali (sieri, urine, tessuti, ecc), possono essere presenti proteine in grado di modificare i traccianti enzimatici (proteasi), oppure di inibirne l’attività. L’uso dell’anticorpo secondario consente un’amplificazione della risposta del saggio, poiché quando si lavora con il solo anticorpo primario la sensibilità dell’analisi è fortemente influenzata dall’affinità del sistema Ag-Ab-E.

23 Sensibilità concentrazione dell’analita, sensibilità del sistema di rivelazione, affinità dell’anticorpo da usare, tempo di incubazione tempo di sviluppo del prodotto enzimatico, precisione del saggio volumi impiegati. Sensibilità (analitica) : capacità di un metodo di distinguere piccole variazioni di concentrazione di analita. Nella terminologia abituale immunochimica: capacità di un metodo di distinguere da zero piccole concentrazioni di analista, inversamente correlata al limite di rivelazione o di misura, o alla minima concentrazione misurabile (rivelabilità). Specificità (analitica) : capacità di un metodo di determinare esclusivamente l’analita; assenza di reattività nei confronti di sostanze interferenti

24 L’enzima da utilizzare in un saggio ELISA deve possedere i seguenti requisiti: 1 - deve essere stabile in un intervallo di temperatura compreso fra 25 e 37° C, con un tempo di vita di almeno sei mesi a 4° C 2 - deve essere disponibile commercialmente e ad un prezzo ragionevole 3 - la sua attività deve essere facilmente misurata con opportuni tests (colorimetrici, fluorimetrici, ecc.) 4 - deve essere facilmente dosabile e possedere un alto numero di turn-over e inoltre il suo prodotto di reazione deve avere un alto coefficiente di estinzione molare 5 - non deve risentire degli effetti negativi della matrice in cui eventualmente è svolto il saggio Gli enzimi normalmente più usati sono la perossidasi da rafano, la fosfatasi alcalina da intestino di vitello, la  -D-galattosidasi da Escherichia coli, l’acetilcolinesterasi da Electrophorus electricus. Scelta dell’enzima

25 STUDIO DEI PARAMETRI DI UN IMMUNOSAGGIO  Coating:  concentrazione dell’Ag (o Ab) forza ionica  tampone pH  tempo  temperatura  Bloccaggio:  natura del bloccante  tampone  tempo e temperatura  Competizione:  modalità  tempo e temperatura  Substrato delle reazioni enzimatiche e tempo di reazione  Lavaggio:  uso di tensioattivi  modalità  tempo

26 ANALISI DEI DATI Y = (a - d)/[1 + (x/c) b ] + d Modello logit-it logistico a “4 parametri” a = valore asintotico del massimo (dose massima) b = pendenza del tratto rettilineo della sigmoide c = IC 50, ovvero concentrazione dell’analita nel campione in grado di legare il 50% dell’anticorpo d = valore asintotico del minimo (dose 0) Curva di concentrazione/risposta (curva standard, di calibrazione, di taratura) : espressione grafica dell’andamento della risposta del saggio al variare della concentrazione dell’analita (standard) utilizzata come scala di calibrazione per interpolare le risposte relative ai campioni incogniti.